Recunoașterea enzimei-substrat în reacțiile de pliere a proteinelor catalizate - Descărcare gratuită PDF
Recunoașterea enzimei-substrat în reacțiile catalizate de pliere a proteinelor
Recunoașterea enzimei-substratului în reacțiile catalizate de pliere a proteinelor Disertație pentru obținerea diplomei universitare doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) Prezentată la Facultatea de Științe Naturale I Biosciences de la Universitatea Martin Luther Halle-Wittenberg de către chimistul absolvent Caroline Haupt născută pe 28 iunie 1980 în Karlsburg Halle (Saale) 2009
Cerere de doctorat depusă la: 8 octombrie 2009 Ziua colocviului științific: 21 decembrie 2009 Recenzant: (1) Prof. Dr. Milton T. Stubbs (2) Prof. Dr. Jochen Balbach (3) PD Dr. Jochen Reinstein
Adevăratul om de știință ascultă inteligența naturii și vede natura lucrurilor. Anthony G. E. Blake
Cuprins 3.2.3. Discuție sumară: localizarea site-urilor de legare în SlyD * și caracterizarea activității chaperone. 103 3.3. Funcția peptidil prolil izomerază a SlyD *. 105 3.3.1. Importanța mutației Y68W pentru mecanismul catalitic al prolil izomerazei SlyD *. 105 3.3.2. Studiu RMN în timp real pentru a cataliza replierea RNasei T1 (S54G/P55N). 107 3.3.2.1. Spectroscopie 3D RMN pentru atribuirea intermediarului de pliere cinetică a RNase T1 (S54G/P55N). 108 3.3.2.2. Descoperirea spectroscopică RMN a unei a doua conformații în RNaza T1 nativă (S54G/P55N). 111 3.3.2.3. Observarea catalizei de repliere prin spectre 2D 1 H/15 N-TROSY-HSQC înregistrate în serie. 113 3.3.3. Discuție sumară: Observarea în timp real a RMN a SlyD * a îndoit catalizat intermediarul pliant tranzitoriu al RNase T1 (S54G/P55N). 119 4. Rezumat. 121 5. Rezumat. 123 6. Lista abrevierilor. 125 7. Bibliografie. 129 8. Anexă. 143 8.1. Ilustrații. 143 8.2. Mese. 159 8.3. Programe de impulsuri. 175 8.4. Felix macro-uri. 191 9. Publicații proprii. 193 10. CV. 194 11. Mulțumiri. 195 III
Temperatura de introducere și condițiile catalitice sunt optimizate. În plus, dezvoltarea și adaptarea metodelor RMN în timp real care trebuie utilizate sunt necesare pentru această întrebare. Scopul prezentei lucrări ar trebui, prin urmare, să fie înțelegerea moleculară a catalizei reacțiilor de pliere lentă de către PPIases, precum și comunicarea domeniului între domeniile chaperone și PPIase ale SlyD *. 19
Dimensiunea materialelor și metodelor înregistrate. Durata unui spectru FHSQC a fost de 4 min 52 s. Evaluarea spectrelor a fost efectuată în mod analog titrărilor RMN și analiza schimbării chimice utilizând ecuația [2.14]. 59
Rezultatele și discuțiile marcate. Volumul semnalelor încrucișate este utilizat pentru a evalua tranziția de dezvoltare. Se observă o scădere a volumului pentru vârfurile încrucișate ale speciilor native și o creștere a volumului pentru semnalele speciilor denaturate cu o schimbare chimică diferită. Un total de 93 de resturi de aminoacizi ar putea fi evaluate pentru starea nativă (Anexă, Tab. 8-1). Fig. 3-6 Spectrele 1 H/15 N TROSY ale SlyD * în timpul desfășurării induse de uree. Un spectru de SlyD * în starea nativă la 0 M uree, B în starea desfășurată la 5,5 M uree și C la punctul mediu de tranziție la 2,2 M uree. Tranziția a fost măsurată în 50 mm Na2 HPO4, 100 mm NaCI, 10% D20, pH 7,5 la 15 C și o concentrație de proteină de 0,67 mm. Curba de tranziție corespunzătoare pentru semnalele încrucișate atribuite este prezentată în Fig. 3-7. Câteva exemple de semnale încrucișate care prezintă o curbă de tranziție conform modelului cu două stări sunt prezentate în Fig. 3-7. Reziduuri ale căror vârfuri transversale au fost de 68
Rezultate și discuții A B Fig. 3-14 Schimb H/D al SlyD *. A Factorii de protecție ai protonilor amidei coloanei vertebrale ale SlyD * într-un complot logaritmic. Dreptunghiurile reprezintă elemente structurale secundare, dreptunghiurile umplute reprezintă β-foi, cele deschise pentru α-elice. B Zonele cu factor de protecție ridicat (S> 10 4, albastru) și scăzut (10 2 S 10 4, cian) plasate pe structura SlyD *. Factorii de protecție au fost calculați conform ecuației [2.26]. Zonele în care respectivele semnale transversale s-au schimbat în timpul mort al experimentului (40 de minute) sunt afișate în gri. Reziduurile și prolinele neatribuite sunt colorate în negru. Schimb de protoni amidici pentru determinarea reacțiilor de schimb rapid Cu tehnica MEXICO modificată (New MEXICO, 2.7.6.) Procesele de schimb pot fi determinate într-o fereastră de timp de la 10 ms la 250 ms. Pentru 47 de protoni amidici, al căror schimb pentru protoni cu solvent nu a putut fi detectat cu schimb de H/D din cauza protecției mai mici, au fost analizate rate de schimb mai mari cu New MEXICO în fereastra de timp specificată. Fig. 3-15D arată reconstrucția magnetizării protonilor amidici prin schimbarea protonilor de apă polarizată. 78
Rezultate și discuții Fig. 3-15 Schimb rapid de protoni amidici (Noul MEXICO). Spectre A-C 1 H/15 N-FHSQC înainte de schimbul protonului amidic (referință) și 60 ms sau 250 ms după începerea reacției de schimb. D Cinetică de schimb pentru resturi de aminoacizi selectați de SlyD * la pH 7,5 și 15 C. Adaptarea cineticii la o funcție mono-exponențială a dus la rate de schimb de 512 ± 5 s -1 (R95), 37 ± 3 s -1 (G86), 14 ± 2 s -1 (S40) și 12 ± 2 s -1 (Q102). Erorile specificate rezultă din adaptarea la o funcție mono-exponențială. O evaluare a reacțiilor de schimb în ceea ce privește stabilitatea termodinamică poate fi efectuată numai dacă procesul de schimb se desfășoară în conformitate cu mecanismul EX2 (2.7.6). Datorită dependenței de ph a apartenenței la mecanismul EX1 sau EX2, experimentul Noul MEXICO a fost repetat cu alte două valori ph (ph 6.0, ph 9.0). O tranziție la intervalul EX1 ar putea fi observată pentru 20 de reziduuri la o valoare pH ridicată. Acestea sunt omise pentru o considerație termodinamică. Factorii de protecție și stabilitatea termodinamică au fost calculați pentru restul de 27 de resturi de aminoacizi conform ecuației [2.26] (Anexă, Tab. 8-8). 79
7,0 kj/(m mol). Prezența domeniului IF înseamnă pentru SlyD * comparativ cu domeniul FKBP izolat (SlyD * - IF, G U (H 2 O)
4,7 kj/(m mol)) un câștig enorm în stabilitate și o cooperativitate mult crescută. Acesta este motivul dezvoltării concertate a ambelor domenii. SlyD * se desfășoară ca o unitate de pliere cooperativă în care niciunul dintre cele două domenii nu poate fi desfășurat local atunci când celălalt este pliat. Cu ajutorul teoriei schimbului de hidrogen în stare nativă s-ar putea arăta, de asemenea, că FKBP se desfășoară ca o unitate cu domeniul IF, deoarece nu au putut fi detectate stări intermediare parțial pliate sau subunități pliante. Stabilizarea termodinamică semnificativă a SlyD (1-155) are loc în prezența Ni 2+. Prin comparație cu structura cristalină a TtSlyD (Löw și colab., 2009), situsul de legare al ionului metalic ar putea fi localizat. Se află în ultima α-helix (α3) din domeniul FKBP într-un motiv histidinic: His149-Gly150-His151-Val152-His153 în E.c.SlyD sau His145-Gly146-His147-Ala148-His149 în TtSlyD. Această ultimă α-helix este unică printre proteinele care leagă FK506 și apare numai în FKBP care sunt omoloage cu SlyD. Astfel, nu numai că reprezintă un nou element structural, ci și un nou element funcțional
Lista abrevierilor 6. Lista abrevierilor 1D, 2D, 3D, una, două, tridimensionale A 280 nm AcCN Amp A.U. a.u. bp BEST BSA sau c CD CsA C p δ MW G u (H 2 O) H u (T m) S u (H 2 O) n d [D] [D] 1/2 ddh2o ADN DTT dyt ε E A E.c. (E. coli) EDTA ESI FID FKBP absorbție la 280 nm unități de absorbție a acetonitrilului ampicilină unități arbitrare pereche de baze (ADN) excitație selectivă pe bandă ser albumină bovină tranzitorie scurtă (ser albumină bovină) sau concentrație dicroism circular Ciclosporină entalpia de stabilizare fără schimbare chimică în absența denaturantului Van t Hoff modificarea entalpiei în entropie în timpul desfășurării diferența în indicii de refracție grosimea stratului cuvei (în dm) concentrația denaturantului punctul de tranziție cu ape dublă deionizată indusă de denaturant (conductivitate reziduală 0,055µ Acid sithiotreitolic (acid triptoneucleic mediu) ) coeficient de extincție molară energie de activare Escherichia coli etilendiaminetetraacetat electrospray ionizare inducție liberă degradare FK505 proteină de legare 125
Lista abrevierilor FT GdmCl HCl HMQC hnoe HSQC Hz (MHz, GHz) IF INEPT IPTG ITC k 0 k cat k cat/KM k ch k cl KDK eq k int k kat KK KM k op N n NaOH NMR NOE NOESY M m (Nou) MEXICO min min. Transformare Fourier clorură de guanidiniu acid clorhidric heteronuclear coerență cuantică multiplă efect NOE heteronuclear coerență cuantică unică heteronucleară Hertz (s -1) (megahertz, gigahertz) insert-in-clapă îmbunătățirea nucleilor insensibili prin transfer de polarizare izopropil-β-D-thicogalactopyranoside catalizat Rata de rulare Eficiența catalitică a unei enzime Rata de schimb chimică Rata de închidere de disociere Echilibrul constant Rata de schimb intrinsec constantă (determinată pentru modelul peptidelor) Rata reacției de repliere catalizată peptidă hidrofobă din secvența peptidică semnal HiPIP cu două lizine în locul argininei Michaelis-Menten rată de deschidere constantă stare nativă rezonanță magnetică nucleară stoechiometrie sodiu Îmbunătățire Nuclear Overhauser Spectroscopie de îmbunătățire Molar (mol/l) Măsurarea parametrilor de cooperare a ratelor de schimb rapide ale protonilor în compuși etichetați izotopic nds minute cel puțin 126
Lista abrevierilor MS Ni-IMAC OD P PCR PPIase ppm RCM-T1 RCM-α-La RNase T1 RR s SDS-PAGE SlyD SlyD * SOFAST SUMO T m Tat Tat27 TEMED TFA TFE TOCSY TPPI (Bis-) Tris TROSY U etc. Rpm etc. UV VRR (v/v) WATERGATE WHP Spectrometrie de masă Ni-ion metal afinitate cromatografie densitate optică factor de protecție polimerază reacție în lanț peptidil-prolil-cis/trans-izomerază părți pe milion redus și carboximetilat RNază T1 redus și carboximetilat α-lactalbumin ribonuclează T1 hidrofob peptic Secvență peptidică semnal a doua Dodecil sulfat de sodiu poliacrilamidă gel electroforeză sensibilitate la liză D EcSlyD (1-165) bandă selectivă optimizată cu flip-unghi scurt, tranzitorie mică, asemănătoare temperaturii modificatorului ubiquitinei la centrul de tranziție, secvență peptidică semnal translocon twin-arginină din CueO N, N, N, N -Tetrametildiamină Acid trifluoroacetic Trifluoroetanol spectroscopie corelație totală timp proporțional incrementare fază Tris- (hidroximetil) aminometan relaxare transversală spectroscopie optimizată stare desfășurată, printre altele, rotații pe minut în anumite circumstanțe peptida hidrofilă ultravioletă din semnalul HiPIP secvență peptidică volum pe volum wat suprimarea prin excitare cu gradient taylored proteină minunată bogată în histidină 127
Lista abrevierilor (w/v) YpSlyD de ex. Greutatea pe volum SlyD de la Yersinia pestis, de exemplu, aminoacizii, a fost prescurtată cu codurile obișnuite de una sau trei litere. 128
Anexa 8. Anexa 8.1. Figuri Fig. 8-1 Spectru de emisie de fluorescență de 5 µm SlyD * în 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCI, pH 7,5 la 15 C. Excitația a avut loc la 278 nm. Linia continuă reprezintă starea nativă, curba pentru starea desfășurată Proteinele sunt prezentate în linii punctate. Fig. 8-2 Tranziția de desfășurare indusă de uree a SlyD * -F84W. Detectarea tranziției la 308 nm după excitație la 280 nm (triunghiuri), detectare la 344 nm după excitație la 295 nm (cercuri). Liniile solide reprezintă adaptarea datelor la modelul cu două stări. Parametrii de stabilitate rezultați sunt (după excitație la 280 nm): GU (H 2 O) = 16,8 ± 0,7 kj/mol, m eq = 6,8 ± 0,3 kj/(m mol), [D] 1/2 = 2,5 M. A doua tranziție, care este prezentată mărită în B, nu a putut fi evaluată. Linia continuă este doar pentru o vizualizare mai ușoară. Tranziția a fost măsurată în 50 mm Na2 HPO4, 100 mm NaCI, pH 7,5 la 15 C. Concentrația de proteine a fost de 5 pm. 143
Anexa Fig. 8-3 Tranziție de dezvoltare indusă de uree de la SlyD * - IF. Tranziție de desfășurare de la SlyD * (simboluri deschise) și SlyD * - IF (simboluri închise). Liniile solide reprezintă adaptarea datelor la modelul cu două stări. Parametrii de stabilitate rezultați sunt pentru SlyD *: GU (H 2 O) = 18,4 ± 0,6 kj/mol, m eq = 6,9 ± 0,2 kj/(m mol), [D] 1/2 = 2,7 M și pentru SlyD * - IF: GU (H 2 O) = 13,9 ± 0,5 kj/mol, m eq = 3,2 ± 0, 1 kj/(m mol), [D] 1/2 = 4,3 M Tranzițiile au fost măsurate în 50 mm Na2 HPO4, 100 mm NaCI, pH 7,5 la 15 C. Concentrația de proteină a fost de 5 pm. Fig. 8-4 Date calorimetrice de titrare izotermă a două SlyD-uri omoloage cu Ni 2+. Cantitatea integrată de căldură a fost reprezentată grafic în raport cu concentrația ligand/proteină. Două evenimente de legare pot fi văzute în fiecare caz, dar nu a fost posibilă adaptarea datelor la un model de legare corespunzător din cauza proceselor interconectate. O titrare izotermă de 18 um TtSlyD-His 6 cu 270 um NiCI2 (în 10 mm Tris, pH 25 C 7,5, 25 C). B Titrare izotermă de 16 µm E.c.SlyD (1-165) -His 6 cu 240 µm NiCl 2. 144
Anexa Fig. 8-5 Curbele calorimetrice de titrare izotermă a TtSlyD cu Co 2+, Gd 3+ și Zn 2+. Figura superioară arată puterea electrică care a fost detectată după fiecare injecție a ionului metalic respectiv. În figura de mai jos, cantitățile integrate de căldură sunt reprezentate grafic în raport cu concentrația ionului metalic/TtSlyD. Parametrii termodinamici au fost obținuți dintr-o potrivire neliniară la datele experimentale pe un model de legare cu un situs de legare. O titrare izotermă de 27 µm TtSlyD cu 270 µm CoCI2 (în 10 mm Tris, pH 25 C 7,5, 25 C). Entalpia de reacție eliberată prin legare a fost -13,2 ± 0,2 kcal/mol; constanta de afinitate a fost de 2,4 ± 0,2 x 106 M -1. Acest lucru a dus la o valoare KD de 420 nm. Datele prezentate în roșu corespund titrării TtSlyD cu GdCl 3. Nu s-a putut determina legarea Gd 3+. B Titrare izotermă de 27 µm TtSlyD cu 270 µm ZnCl 2 (în 10 mm Tris, pH 25 C 7,5, 25 C). Entalpia de reacție eliberată prin legare a fost aici -10,0 ± 0,1 kcal/mol; constanta de afinitate a fost de 9,8 ± 1,5 x 106 M -1. Valoarea K D rezultată a fost de 102 nm. 145
Anexă Fig. 8-6 Titrarea RMN a 15 N-SlyD * cu RNaza nativă T1 (S54G/P55N) în 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCI, pH 7,5 la 25 C. Modificarea schimbării chimice a unor vârfuri încrucișate se bazează pe interacțiuni nespecifice ale părții C-terminale nestructurate și eticheta His 6. Fig. 8-7 Titrarea detectată prin fluorescență a Tat27 cu SlyD * în 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCI, pH 7,5 la 25 C. Linia solidă corespunde adaptării la un model simplu de legare cu un singur situs de legare. O stoichiometrie de 1 are ca rezultat o constantă de disociere de 0,5 ± 0,1 µm. Secvența de aminoacizi a peptidei Tat: QRRDFLKYSVALGVASALPLWSRAVFA. 146
Anexă Fig. 8-8 Titrarea a 15 N-SlyD * cu RCM-T1. Dependența modificării schimbării chimice de raportul de concentrație RCM-T1 la SlyD * (A) și de concentrația substratului RCM-T1 (B) pentru cei doi protoni amidici ai D88 și S26 din titrarea RMN. A Curba de legare a echilibrului se obține din potrivirea liniară. Punctul de echivalență este în jur de 1 și indică un complex 1: 1. B Liniile solide sunt destinate doar să ghideze ochiul, dar nu au nici un sens fizic. C Titrarea detectată prin fluorescență a RCM-T1 cu SlyD *. Linia continuă corespunde adaptării la un model simplu de legare cu un punct de legare. O stoichiometrie de 1 are ca rezultat o constantă de disociere de 4,4 ± 0,8 µm. Ambele titrări au fost efectuate în 50 mm Na2 HPO4, 100 mm NaCI, pH 7,5 la 25 C. 147
Anexa Fig. 8-9 1 H/15 N-FHSQC spectrul domeniului IF izolat în prezența 0,5 M (NH 4) 2 SO 4 la 25 C. Vârfurile încrucișate ale speciilor desfășurate se găsesc în principal în mijlocul Spectrul de la 7,8 la 8,4 ppm. Intensitatea semnalelor dispersate ale speciilor structurate este de aproximativ 30%. Fig. 8-10 Secvența spectrelor 1D 1 H de 450 µm insulină după începerea reacției de agregare la 25 C prin adăugarea DTT. Este prezentată zona cu câmp redus, cu câteva semnale de la protonii amidici ai lanțului A. 148
Anexă Fig. 8-13 1 H/15 N-heteronuclear NOE la 14,2 T și 25 C pentru SlyD * (negru) și SlyD * -Y68W (roșu). Dinamica diferită a celor două domenii din cele două proteine poate fi văzută clar pe scara de timp RMN a nanosecundei picobis; domeniul IF este mult mai flexibil decât domeniul FKBP. În zona din jurul W68, mutantul prezintă o dinamică crescută. Datele hno-urilor au fost puse la dispoziție de Michael Kovermann. Fig. 8-14 Stabilitate termodinamică a SlyD * față de GdmCl. Tranziția de dezvoltare indusă de GdmCl a SlyD * în 10 mm Tris, ph 20 C 7,5 la 20 C (A) și în 10 mm Bis-Tris, ph 10 C 6,0 la 10 C (B). Liniile solide reprezintă adaptarea datelor la modelul cu două stări cu următorii parametri de stabilitate: GU (H 2 O) = 15,3 ± 1,4 kj/mol, m eq = 13,7 ± 1,1 kj/(m mol) și [D] 1/2 = 1,1 M (ph 7,5, A) sau GU (H 2 O) = 12,0 ± 0,8 kj/mol, m eq = 13,0 ± 0,6 kj/(m mol) și [D] 1/2 = 0,9 M (ph 6,0, B). Concentrația de proteină a fost de 2 um (A) și 5 um (B). Erorile rezultă din adaptarea datelor la ecuația [2.10]. 150
Anexa 10 9 8 7 6 5 1 H (ppm) Fig. 8-15 Spectre 1 H ale SlyD * în 10 mm Tris, ph 20 C 7,5 în prezența GdmCl. Rezoluția redusă și intensitatea semnalului în prezența GdmCl (0,4 M GdmCl (spectru roșu) și fără GdmCl (spectru albastru)) pot fi văzute clar. 151
Anexa Fig. 8-16 grafic stivuit pentru replierea RNase T1 (S54G/P55N). Secvența spectrelor 1D 1H de 1,9 mm RNase T1 (S54G/P55N) în absență (A) și prezența SlyD * (B) de 190 µm. Este prezentată regiunea cu câmp redus cu regiunea protonului amidic. Rezoluția timpului pe spectru a fost de 5 min 21 s, deoarece patru spectre consecutive au fost mediate pentru a îmbunătăți raportul semnal/zgomot. 152