Reglarea citoscheletului actinei în celulele acinei pancreatice de către tirozin kinaza Da - PDF

Universitatea din Ulm, Departamentul de Medicină Internă I Șef Prof. G. Adler Reglarea citoscheletului actinei în celulele acinoase pancreatice de către tirozin kinaza Da Disertație pentru obținerea titlului de doctor în biologie umană (Dr. biol. Hum.) De la Facultatea de Medicină a Universității din Ulm, prezentată de Grit Lynch din Frankenberg 2002

Decan interimar: prof. Klotz 1. Reporter: PD Dr. Lutz al doilea reporter: Dr. Ziua doctoratului: 20 decembrie 2002

Dedicare Părinților mei care mi-au susținut întotdeauna visele

Cuprins 1 CUPRINS CUPRINS. 1 ABREVIERI. 3 1. INTRODUCERE. 5 2. SCOP. 19 3. MATERIAL ȘI METODE. 20 3.1. Material și animale. 20 3.1.1. ANTICORP. 20 3.1.2. PRODUSE CHIMICE. 21 3.1.3. ANIMALE. 21 3.2. Metode. 22 3.2.1. ISOLAREA AZINII DIN PANCREELE DE ȘOBILI. 22 3.2.2. STUDII DE SECRETARE A AMILAZEI ÎN AZINI DE ȘOAPEL PROPUT ISOLAT. 23 3.2.3. PATA IMUNEFLUORESCENTĂ. 23 3.2.4. PRODUCȚIA EXTRACTELOR DE PROTEINE. 24 3.2.5. DETERMINAREA CONCENTRĂRII PROTEINELOR. 25 3.2.6. FRACȚIONAREA SUBCELULARĂ. 26 3.2.7. IMUNPRECIPITARE. 27 3.2.7. ANALIZA ELECTROFORETICĂ A GELULUI PROTEINELOR PE SDS-PAGE. 28 3.2.8. BLOTAREA DE VEST. 29 3.2.9. DETECTAREA PROTEINELOR CU ANTICORPI. 29 3.2.10. CENUIREA INDIA. 30 3.2.11. ACTIVITATEA KINASE A DA. 31 3.2.12. EVALUAREA DENSITOMETRICĂ A IMUNOBLOTELOR. 32 3.2.13. ISOLAREA ARNULUI DIN AZINI. 32 3.2.14. VERIFICAREA PURITĂȚII ȘI CALITĂȚII ARN-ului. 32 3.2.15. HIBRIZAREA GENERALITĂȚILOR. 34 4. REZULTATE. 37

Cuprins 2 4.1. Reglarea la nivel de proteine. 37 4.1.1. EXPRIMAREA PROTEINELOR DIN KINASELE SRC. 37 4.1.2. FOSFORILAȚIA TIROZINICĂ DE LA DA LA STIMULAREA CCK. 38 4.1.3. ACTIVITATEA DE CINEMA DA. 41 4.1.4. LOCALIZAREA ȘI REDISTRIBUIREA DA. 44 4.1.5. CORELAREA ÎNTREPRINDEREA ACTINULUI ȘI ACTIVITATEA DA. 46 4.1.6. SECRETIA DE LA AZINI ISOLAT. 49 4.1.7. PROTEINE ASOCIATE DA. 51 4.2. Expresia genelor. 53 4.2.1. TESTAREA CONCENTRAȚIILOR PENTRU ISOLAREA ARN-ului. 54 4.2.2. EXPRIMAREA GENICĂ DUPĂ STIMULARE CU CCK. 55 5. DISCUȚIE. 60 5.1. Reglarea proteinelor. 60 5.2. Expresia diferențială a genelor. 66 6. REZUMAT. 69 7. LISTA LITERATURII. 71 ANEXĂ. 83

Abrevieri 3 ABREVIAMENTE Fig Figura Apă Dublu distilat de apă BSA Ser albumină CCK Colecistokinină CCK-R CCK Receptor ECM Extracellular Matrix et al și alții Exp Experiment FAK Adeziune focală Kinază g grame IB Imunoblot IF Imunofluorescență IgG Imunoglobulină G Imunoprecipitare IP + Ușor (ambele lanțuri de IgG) HRP peroxidază de hrean (peroxidază de hrean) kda kilodalton kg kilogram M molar min minut mk monoclonal ml mililitru µg microgram N normal nm nanometru nm nanomolar PBS soluție salină tamponată cu fosfat PMSF fenilmetilen sulfonil fluorură pk policlonală

Abrevieri 4 pm PVDF picomolar poliviniliden difluorură Pyk2 tirozin kinază bogată în prolină 2 RT temperatura camerei SDS sodiu dodecil sulfat Eroare standard SEM SH Src omologie TBS Soluție salină tamponată Tris Tirozină de exemplu de exemplu

1. Introducere 12 Joncțiunea Adherens (Ohkubo și colab. 1999). p120ctn nu este direct implicat în interacțiunea proteină-proteină cu sistemul filamentului de actină, deoarece nu se poate lega de α-catenină. Un posibil mecanism de reglare a proteinelor zonula adherens este fosforilarea tirozinei, deoarece β- și γ-catenina, precum și p120ctn, pot fi tirozina fosforilată prin stimulare cu factori de creștere (Hazan și colab. 1998; Rosato și colab. 1998). P120ctn stabilizează aderența celulă-celulă prin legarea la E-cadherină (Yap și colab. 1998); aceasta este inhibată de hiperfosforilarea p120ctn în timpul mitozei (Hazan și colab. 1998). Fosforilarea tirozinei cateninelor ar putea juca un rol cheie în stabilitatea sau instabilitatea zonulei aderente și, astfel, ancorarea sistemului filamentului de actină cu membrana plasmatică (Behrens și colab. 1993). În studiile efectuate pe acini izolate, s-a observat, de asemenea, o modificare a gradului de fosforilare a p120ctn după stimularea cu concentrații secretoare supramaximale de CCK (Leser și colab. 2000).

1. Introducere 14 FAK și paxilina în cauză. Toate cele 3 proteine au fost descrise ca substraturi ale kinazelor Src în alte sisteme celulare (Calautti și colab. 1998); (Schlaepfer și colab. 1999; Shen și colab. 2001). Familia kinazelor Src include 9 proteine cu omologie structurală pronunțată. Majoritatea kinazelor din familia Src sunt exprimate numai în celule hematopoietice, unde sunt adesea redundante, așa cum s-a arătat în modelele knock-out (Smith și colab. 2001). Pe de altă parte, kinazele Src Da, Lyn, Fyn și Src sunt exprimate omniprezent și par să-și asume roluri diferite (Thomas și colab. 1995). Kinazele Src sunt localizate inițial în citoplasmă și, ca enzime active, se leagă aproape exclusiv de membranele celulare. Pe baza omologiilor de secvență, se pot diferenția un total de șase domenii relevante funcțional cu sarcini diferite (Fig. 3). (Brown și colab. 1996)

1. Introducere 17 a proteinei pliate și nu poate fi fosforilată (Gonfloni și colab. 2000). Legarea substraturilor la domeniul SH2 este, de asemenea, dificilă. Există mai multe opțiuni pentru activarea kinazelor Src: Deposforilarea Tyr 527 printr-o legare competitivă a fosfatazei unui substrat cu afinitate ridicată la domeniul SH2 sau SH3, prin care Tyr 527 fosforilat este deplasat activator alosteric sau modificare proteică (de exemplu fosforilarea serină/treonină) care este închisă Conformitate destabilizată. În toate cazurile, proteina se desfășoară și autofosforilarea domeniului kinazei este posibilă (Fig. 4). Aceasta activează kinaza. Csk este descris ca o proteină de reglare negativă, care este responsabilă pentru fosforilarea Tyr 527 (Brown și colab., 1996).

1. Introducere 18 PTyr 527 Tyr 527 activ inactiv Fig. 4: Reglarea activității kinazelor Src. În forma inactivă (stânga) proteina se află într-o stare foarte pliată. În forma activă, domeniul SH3 se separă de helixul bogat în prolină, iar domeniul SH2 nu se mai leagă de regiunea cozii (acum cu un reziduu de tirozină nefosforilat). Partea activă leagă ATP (roșu), care menține grupul fosfat pregătit pentru activare. Prima reacție este fosforilarea reziduului de tirozină chiar lângă situsul de legare ATP (autofosforilare). Când această tirozină este fosforilată, enzima este activată la maximum. (după Godsell 2001)

3. Material și metode 20 3. MATERIAL ȘI METODE 3.1. MATERIAL ȘI ANIMALE 3.1.1. Anticorpi În tabelul următor (Tabelul 2) sunt indicați toți anticorpii/antiserurile primare utilizate și sursele acestora. Denumire Specii Producător IB IP IF Da Mouse, mk Transducție 1: 5000 Pyk2 mouse, mk Transducție 1: 1000 Pyk2 iepure, Biomol, pk Hamburg Phosphotyrosine (PY20) mouse, mk Transducție 1: 2500 Src mouse, mk UBI 1: 200 Fyn iepure, pk UBI 1: 500 Lyn Hase, pk Santa Cruz 1: 500 mouse FAK, mk Transducție 1: 1000 P120ctn mouse, mk Transducție 1: 1000 3 5 µg, pentru 350 750 µg proteină 5 µg pentru 750 µg proteină 5 µg pentru 650 µg Proteina 1: 1000 1: 200 Tabelul 2: Anticorpi primari Toți anticorpii secundari cuplați cu peroxidaza au fost obținuți de la Pierce. Pentru colorarea imunofluorescentă, anticorpii secundari cuplați Alexa 488 au fost obținuți de la Molecular Probes (Eugene, SUA) și anticorpii secundari cuplați Cy3 de la Dianova (Hamburg).

3. Material și metode 21 3.1.2. Substanțe chimice Denumire Aminoacizi (neesențiali, MEM 100x) CCK-8, sulfat (CCK 25-32) Colagenază, (CLSPA) L-Glutamină Oregon Green-Phalloidin Bovine Ser Albumin (BSA) Soia Trypsin Inhibitor Producător Life Technologies, Karlsruhe Bachem, Bubendorf, Elveția Worthington, Cell Systems, Hamburg Life Technologies, Karlsruhe Molecular Probes, Eugene, Oregon, SUA Fluka, Buchs Boehringer, Mannheim Tabelul 3: Substanțe Dacă nu se specifică altfel în text, toate celelalte substanțe chimice au fost enumerate în p. A. sau calitate ultra pură de la producătorii Fluka (Buchs), Merck (Frankfurt), Roth (Karlsruhe) și Sigma (Deisenhofen). 3.1.3. Animale Animalele testate au fost șobolani masculi Wistar din tulpina consangvinizată WAG/RijCrl (Charles River, Sulzfeld). Animalele au fost ținute în grupuri cu maximum 3 șobolani pe cușcă în condiții de lumină-întuneric controlate, cu o fază întunecată de 12 ore între orele 19:00 și 07:00. Camerele au aer condiționat (temperatura camerei 21 C, umiditate 55%). Animalele au fost hrănite cu reproducerea Altromin și ținând dieta ad libitum. În experimente, am folosit șobolani cu greutatea de 100-200 g, care au fost postiti peste noapte.

3. Material și metode 24 blocate în PBS. Anticorpii primari (în PBS) au incubat fie timp de 1 oră la temperatura camerei, fie peste noapte la 4 C. Lamele au fost apoi spălate de trei ori cu PBS. Incubația cu anticorpul secundar cuplat cu fluorocrom sau cu faloidină conjugată Oregon Green de 0,2 um a avut loc timp de două ore pe întuneric la temperatura camerei. Lamele au fost apoi spălate de trei ori înainte ca acinele să fie încorporate în Mowiol (Calbiochem, Bad Soden) și aplicate pe lamele. Analiza colorării imunofluorescente a fost efectuată cu un microscop confocal cu scanare laser (TCS 4D, Leica, Heidelberg). 3.2.4. Producerea de extracte de proteine În funcție de problemă, au fost utilizate următoarele tampoane de liză. Deoxicolat/tampon de liză Triton: Tris/HCI, pH 7,5 50 mm NaCl 150 mm EGTA 1 mm EDTA 0,4 mm Triton X-100 1% deoxicolat 1% (greutate/vol) Na ortovanadat 0,5 mm Na- Fluorură 5 mm inhibitor de tripsină din soia 1 mg/ml PMSF 1 mm aprotinină 1,4 µg/ml leupeptină 10 µg/ml Acest tampon a fost utilizat pentru analiza proteinelor fosforilate cu tirozină și determinarea activității kinazei.

3. Material și metode 25 tampon de liză DTT/Triton X-100 (conform Antibody Array, Biocat, Heidelberg): Tris/HCl, pH 7,5 15 mm NaCl 120 mm KCl 25 mm EGTA 2 mm EDTA 2 mm DTT 0,1 mm Triton X-100 0,5% Na ortovanadat 0,5 mm Fluor Na 5 mm Soia inhibitor al tripsinei 1 mg/ml PMSF 1 mm aprotinină 1,4 µg/ml leupeptină 10 µg/ml Acest tampon a fost utilizat pentru co-imunoprecipitare complexele proteine Yes-Pyk2 utilizate. Stimulările respective au fost oprite prin adăugarea de tampon KRH rece ca gheața și apoi celulele au fost peletizate la 500 × g. Supernatantul a fost apoi aspirat și acini au fost resuspendați fiecare în 200 400 pl tampon de liză și omogenizați cu ultrasunete timp de 5 secunde. Incubația ulterioară pe gheață a durat 30 de minute pentru izolarea complexelor proteină-proteină și 10 minute pentru toate celelalte izolații. Insolubile au fost peletizate prin centrifugare timp de cel puțin 20 de minute la 10.000xg la 4 ° C. 3.2.5. Determinarea concentrației de proteine Conținutul de proteine din extracte a fost determinat în conformitate cu o metodă modificată Bradford utilizând testul BioRad Protein Assay (BioRad, München) și o linie de calibrare BSA (0,7 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0, 1 mg/ml).

3. Material și metode 28 3.2.7. Analiza electroforetică pe gel a proteinelor prin tampoane SDS-PAGE utilizate (conform Lämmli 1970): 10 × tampon de rulare SDS Tris 25 mm glicină 191 mm SDS 10% (greutate/volum) gel de separare tampon Tris, pH 8,8 1,5 M SDS 0,4 % Tampon de gel de stivuire Tris, ph 6,8 0,5 M SDS 0,4% 4 x tampon de probă SDS Tris, ph 6,8 250 mm glicerol 40% SDS 10% 2-mercaptoetanol 20% albastru de bromofenol 1 mg Sistemul discontinuu Electroforeza pe gel de poliacrilamidă SDS într-o formă modificată conform Lämmli 1970 utilizată. Mini-Protean II (BioRad, München) a servit ca aparat de electroforeză. S-au aplicat 20 μg de proteină totală a lizatelor sau supernatantul imunoprecipitaților, care anterior au fost amestecate cu tampon de probă 4x SDS și denaturate termic (5 min, 95 ° C). Electroforeza a avut loc la o putere de curent constantă de 20 ma în gelul de colectare și 35 ma în gelul de separare.

3. Materialele și metodele 32 și reacția kinazei au fost efectuate cu o concentrație de ATP de 10 mm la 37 ° C timp de o oră. Toate etapele ulterioare au fost procesate conform instrucțiunilor. Absorbția a fost măsurată la 405 nm (lungimea de undă de referință 620 nm). 3.2.12. Evaluarea densitometrică a imunoblotilor Pentru comparația densitometrică a forțelor benzii, filmele cu raze X expuse au fost scanate cu ajutorul unui scaner de lumină transmisă (Sharp JX-330) și analizate cu software-ul 1D de la Phoretix (New Castle upon Thyne, Marea Britanie). 3.2.13. Izolarea ARN-ului de acini Stimularea acinilor izolați a fost oprită cu PBS fără ARN fără gheață, centrifugată la 1000 rpm timp de 5 minute și supernatantul eliminat. ARN-ul a fost izolat conform protocolului Promega (SV Total RNA Isolation System, Promega, Mannheim). 3.2.14. Verificarea purității și calității determinării concentrației ARN ARN-ul izolat a fost diluat 1: 100 cu apă și absorbția a fost măsurată la două lungimi de undă diferite. Concentrația de ARN a fost calculată din absorbția la 260 nm și puritatea ARN-ului izolat a fost obținută din raportul 260/280 nm. Calculul concentrației: absorbție de 1 = 40 µg/ml

3. Material și metode 34 ușor amestecat. Probele au fost încărcate în gel și separate la 50 V timp de aproximativ 1-2 ore. 3.2.15. Hibridizarea matricelor genetice S-a fiert hibridizarea filtrelor SDS 0,5% și membranele (GF300 - GeneFilters Rat Microarrays Release 1, Res Gen, Invitrogen) au fost incubate cu această soluție timp de 10 minute la temperatura camerei înainte de fiecare prehibridare. 90 pl ADN de spermă de somon (ssdna) au fost fierte timp de 5 minute la 95 ° C și răcite scurt pe gheață. Sdna și 120 pl de trna au fost apoi adăugați la 12 ml de tampon de prehibridare. Prehibridarea a fost efectuată timp de câteva ore la 42 ° C în cuptorul de hibridizare. Tampon de prehibridizare: formamidă 50% SSC 6x Denhardt s 5x NaPO 4 50 mm SDS 0,5% reacție de transcriptază inversă (RT) 25 μg de ARN au fost evaporate în fiecare caz pe 11 μl de lichid în Speed Vac. Kitul Ambion Strip-EZTM RT (Ambion, Austin, TX) a fost utilizat pentru RT. 25 µg ARN/11 µl 2 Ml Oligo (dt) din Ambion. Acest amestec a fost fiert la 65 ° C timp de 5 minute și apoi răcit la 42 ° C. Apoi a fost adăugat următorul:

3. Material și metode 35 2 μl 10x tampon RT 2 μl 10x dntp 1 μl MMLV RT (revers transcriptază) 2 μl (= 20 μci) P 33 -α datp (Amersham) RT a fost efectuat la 37 ° C. timp de 1 2 ore . Purificarea cdna Mai întâi a fost efectuată o digestie ARNseza H pentru a elimina ARN-ul. Pentru aceasta, s-a adăugat 1 pl de ARNseza H la probă și s-a incubat la 37 ° C timp de 30 de minute. ADN-ul a fost purificat folosind trusa de îndepărtare a nucleotidelor (Qiagen, Hilden). După purificare, proba a fost eluată din coloane cu 50 μl EDTA (50 mm). Concurența secvențelor repetitive de cdna Amestec de concurs: 50 µl 20x SSC 70 µl 10 mm Tris ph 8,0 45 µl Șobolan Hybloc (1 mg/ml) (Laboratoarele de Genetică Aplicată, Melbourne, Australia) 20 µl 1% SDS și ADN-ul purificat au fost denaturate separat timp de 5 minute la 95 ° C și răcite imediat pe gheață. Apoi ambele loturi au fost combinate și incubate la 56 ° C timp de 40 de minute. ADNc competitiv a fost pipetat într-o soluție proaspătă de prehibridare și adăugat la filtrele genetice. Hibridizarea a fost efectuată timp de cel puțin 18 ore la 42 ° C în cuptorul de hibridizare.

3. Materiale și metode 36 Spălarea filtrelor Proba a fost aruncată și filtrele au fost spălate de două ori timp de 5 minute cu 2x SSC; 0,1% SDS spălat la RT. Aceasta a fost urmată de două etape de spălare mai stricte la 68 ° C cu 0,2 × SSC; 0,1% SDS timp de 15 minute fiecare. Tablourile genetice au fost plasate între 2 straturi de hârtie de filtru pentru a îndepărta lichidul rămas și înfășurate în folie. A fost aplicat un ecran cu fosfor (Kodak, Stuttgart) timp de aproximativ 5 zile. Semnalul a fost scanat cu ajutorul unui scaner de fosfor (Molecular Dynamics, Amersham Biosciences, Sunnyville, CA) și evaluat cu software-ul Array Vision 6.0 (Imaging Research).

4. Rezultate 37 4. REZULTATE 4.1. REGLEMENTARE LA NIVELUL DE PROTEINE 4.1.1. Exprimarea proteinelor a kinazelor Src Pentru a investiga modelul de exprimare a proteinelor kinazelor Src în celulele pancreatice acinare ale șobolanului, 20 μg de proteine totale au fost extrase din acini izolate din pancreasul de șobolan și separați prin electroforeză. Proteina a fost transferată la membrana PVDF într-o Western blot și examinată pentru a se vedea expresia kinazelor exprimate omniprezent din familia Src. Au fost folosiți anticorpi împotriva kinazelor Da, Src, Lyn și Fyn. Da și Lyn sunt exprimate în celulele pancreatice acinare ale șobolanului WAG, în timp ce Src și Fyn nu au putut fi detectate (Fig. 5). Pentru kinaza Src folosim un control (lizat celular al liniei celulare A431), deoarece Src este descris în celulele acinare în literatura de specialitate (Nozu și colab. 1999). Cu toate acestea, kinaza Src nu poate fi detectată la șobolanii noștri. IB: Da Lyn Fyn Src 1 2 3 4 5 Fig. 5: Exprimarea kinazelor din familia Src în celulele acinare ale șobolanului WAG. Piste 1 până la 4: proteine totale; Banda 5: control pozitiv pentru Src (lizat celular din A431).