Schele 3D cu hidrogel pentru cultura condrocitelor articulare și protocolul de generare a cartilajului

Protocol

Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale subiectului uman al Universității Stanford și protocolul aprobat de Consiliul de revizuire instituțională.

1. izolarea condrocitelor articulare

2. Fabricarea hidrogelului biomimetic

Notă: Această metodă permite sinteza biomimetică a unui hidrogel care conține poli (etilenglicol diacrilat) (PEGDA, MW 5000 g/mol), condroitin sulfat-metacrilat (CS-MA) în DPBS. Adăugarea de photoinitiator permite reticulare fotoactivată. Compoziția finală de hidrogel conține 7% g/v (g/v) PEGDA, 3% g/v CS-MA și 0,05% g/v fotoinitiator.

  1. Sintetizați funcționalizarea CS-MA prin polimerul CS cu grupări de metacrilat.
    1. Se prepară o soluție tamponată de 50 mM acid 2-morfolinoetanezulfonic (MES) și 0,5 M clorură de sodiu (NaCI) dizolvând 1,952 g MES și 5,84 g NaCI în 200 ml apă deionizată (DIH) 2 O). Se dizolvă 5 g de sare de sodiu sulfat de condroitină în soluția tamponată.
    2. Se adaugă 0,532 g (4,62 mmol) N-hidroxisuccinimidă (NHS) și 1,771 g (9,24 mmol) clorhidrat de (3-dimetilaminopropil) carbodiimidă (EDC) 1-etil-3- (raport molar NHS: EDC = 1: 2) la soluția și se agită timp de 5 min.
    3. Adăugați 0,765 g (4,62 mmol) de 2-aminoetil metacrilat (AEMA) (raport molar de NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) la soluție și mențineți reacția la temperatura camerei timp de 24 de ore.
    4. Purificați amestecul prin dializă împotriva apei deionizate (diH20) timp de 4 zile folosind un tub de dializă (12-14 kDa MWCO).
    5. Se filtrează soluția purificată printr-un filtru de 0,22 µm și se plasează tuburile deschise care conțin soluția în desicator și vid O/N. Asigurați-vă că toate tuburile sunt protejate de lumină. Depozitați polimerul dizolvat la -20 ° C departe de lumină și umiditate.

3. Incapsularea celulelor

4. Analiza extracției ARN și a expresiei genei

  1. Aspirați ușor mediul și puneți 1X PBS steril pe celula încărcată împreună cu hidrogelurile de control goale.
  2. Cu ajutorul unei spatule sterile, transferați fiecare hidrogel într-un tub Eppendorf de 1,5 ml curat și adăugați 250 μl de tri-reactiv în fiecare tub. Urmați instrucțiunile producătorului pentru a izola ARN-ul.
  3. După izolarea ARN și cuantificare, utilizați 1 ug din fiecare probă și efectuați transcrierea inversă în ADNc folosind kitul de transcripție inversă ADNc de mare capacitate.
  4. Pentru a utiliza TaqMan Arrays Gene Expression PCR cantitativ pentru examinarea expresiei genelor dvs. de interes. Normalizați nivelurile de exprimare a genelor în interiorul GAPDH.
  5. Pentru condițiile PCR include o incubație de 2 minute la 50 ° C pentru a inactiva ampliconii anteriori cu ADN glicozilaza uracil, urmată de o 1060; min incubare la 95 ° C pentru a activa Taq polimeraza. Apoi efectuați patruzeci de cicluri de PCR, constând din 15 sec la 95 ° C și 1 min la 60 ° C.

5. Analize biochimice

6. Încercări mecanice

  1. Efectuați teste de compresie neconfigurate folosind un sistem de test Instron 5944 echipat cu o celulă de încărcare de 10 N.
    1. După zilele dorite de cultură in vitro, efectuați testul de compresie pe schela cu hidrogel de celule și hidrogeluri de control fără celule.
    2. Scufundați probele într-o baie de PBS la temperatura camerei și comprimați la o rată de tulpină de 1%/sec la o tulpină de până la 15% din tulpina fiziologică 11.12 cunoscută de țesutul cartilajului în condiții de încărcare raportată la 10-20% 13.14.
  2. Creați tensiunea pe baza curbelor de solicitare și potriviți curba folosind o ecuație polinomială de ordinul trei. Determinați modulul compresiv tangent al ecuației de ajustare a curbei pentru valori de solicitare de 15%.

Rezultate reprezentative

Hidrogeli bioactivi care conțin grupuri PEG și CS (Figura 1) reprezintă o platformă ideală pentru cultura și maturizarea condrocitelor articulare umane 2,3,5,7. Condrocitele din diferite vârste și stări de boală pot fi cultivate cu metoda descrisă și analizate pentru a determina fenotipul, expresia genelor și proprietățile biochimice și mecanice ale țesutului cartilajului generat. Trei probe de condrocite, juvenile-6 luni, 34 ani și adult-osteoartritice- 74 de ani, au fost recoltate după 3 săptămâni de cultură în hidrogeli biomimetici 3D. Analiza expresiei genice a condrocitelor normale, atât juvenile, cât și adulții, a arătat o creștere a expresiei genelor condrocitelor COL2A1 și COL6A1. În schimb, condrocitele bolnave au prezentat o scădere dramatică a Col2a1, păstrând în același timp expresia COL6A1. (figura 2) prezintă pierderea fenotipului condrogen în ciuda faptului că a crescut într-un mediu biomimetic favorabil.