Separarea imunomagnetică a protocolului privind celulele stem derivate din adipoză (ASC) specifice depozitului de grăsimi

Introducere

În domeniul obezității și al diabetului, fibroza și inflamația țesuturilor joacă roluri critice în dezvoltarea și menținerea diabetului de tip 2 3. Recent, Tokunaga și colab. a arătat că, din celule înalte izolate inghinale Sca1 (sau subcutanat, SQ) și perigonadal (sau visceral, VIS) 10 semnături genetice diferite și remodelarea ECM in vitro a depozitelor de grăsime C57BL6/J. MMP14 (MT1-MMP), un membru prototip al familiei matrice-metaloproteinază de tip membrană (MMP), mediază dezvoltarea țesutului adipos alb (WAT) prin activitatea sa colagenolitică 1.

Exemple de experimente care pot fi efectuate cu celulele prin următorul protocol includ cultură tridimensională, studii de diferențiere, teste de degradare a colagenului și secvențierea ARN 10,11 izolate și îmbogățite. Testele de degradare trebuie efectuate cu colagen extras cu acid pentru a asigura conservarea telopeptidei 11,12. Următorul protocol va demonstra metodele de izolare a stromei vasculare a celulelor primare din diferite depozite de grăsime și îmbogățirea acestora în celule progenitoare adipocitare utilizând separarea celulelor imunomagnetice. Validitatea sortării celulare poate fi evaluată cu citometrie în flux și prin utilizarea Sca1-GFP - șoareci care exprimă GFP în celule Sca1 +, conduse de un promotor Sca1 13.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Declarație de etică: Comitetul de utilizare și îngrijire a animalelor din Universitatea Michigan (UCUCA) a aprobat toate metodele și protocoalele în conformitate cu ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (Institutul pentru Cercetarea Animalelor de Laborator, Consiliul Național de Cercetare). Șoarecii sunt găzduiți într-un vivariu de la Universitatea din Michigan și au acces gratuit la alimente și apă și sunt păstrați pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore.

2. Izolarea tampoanelor de grăsime subcutanate (SQ)

  1. Eutanasiați șoarecele cu o supradoză de izofluran și pneumotorax.
  2. Pulverizați ușor mouse-ul cu etanol 70% și așezați-l pe spate. Fixați labele pe placa de spumă cu ace de 22 G.
  3. Faceți o mică tăietură în pielea abdomenului. Ținând vârful inciziei cu forcepsul, luați foarfeca și separați pielea înainte de a separa peritoneul.
  4. Odată ce pielea este separată de peritoneu de la abdomen la torace, pielea este oglindită de la peritoneu spre cap prin tăieturi laterale ale pielii de-a lungul părții laterale a corpului.
  5. Oglindați pielea rămasă în zona inghinală, ținând grăsimea departe de corp și fixați-o pe farfurie cu ace de 22 G.
  6. Treceți la foarfece și pensete fine. Prindeți tamponul de grăsime inghinală cu forcepsul la originea din apropierea peritoneului și trageți-l între piele și grăsimea inghinală spre inghină, avansând, evitând ca SQ să contamineze pielea.
  7. Așezați tamponul de grăsime inghinală izolat în tava de 60 mm.

3. Izolarea tampoanelor de grăsime viscerale (VIS)

  1. În mod similar cu pasul 2.5, tăiați peritoneul deschis pentru a dezvălui grăsimea viscerală și bine.
  2. Îndepărtați intestinul spre torace.
  3. Apucați tamponul de grăsime VIS pe capătul distal și trageți-l ușor în sus. Disecați tamponul de grăsime VIS, excluzând cu atenție țesutul epididimal (sau uterin dacă se utilizează șoareci femele).
  4. Așezați în tava de etichete și repetați pasul 3.3 pentru tamponul VIS rămas.

4. Digestia colagenazei a depozitelor de grăsime

6. Verificarea separării imunomagnetice a ACS-urilor Sca1 ridicate utilizând citometrie în flux

  1. Clătiți celulele de două ori cu HBSS (-Ca, -Mg) și disociați celulele folosind 0,05% tripsină.
  2. Centrifugați celulele la 300 xg timp de 5 min. Așezați celulele în 1 ml de mediu de cultură și numărați o cameră de numărare.
  3. Se obțin> 10 6 celule în 1 ml mediu de cultură și se centrifughează la 300 g timp de 5 min.
  4. Îndepărtați supernatantul și repetați pasul 6.3 de încă două ori.
  5. Celulele cu 1 ml de ser de capră 2% + 2% BSA și se blochează timp de 30 de minute la temperatura camerei.
  6. Centrifugați celulele la 300 xg timp de 5 min.
  7. Eliminați soluția blocată.
  8. Adăugați IgG2a Alexa Fluor 647 de șobolan (0,25 pg, 1: 400) sau Alexa Fluor 647 anti-Sca1 (0,25 pg, 1: 400), în 100 pg. l PBS cu 2% ser de capră și 2% BSA + PBS la 4 ° C timp de 30 de minute în întuneric.
  9. Adăugați 1 ml de PBS rece în celule. Centrifugați 300 xg timp de 5 minute la 4 ° C.
  10. Îndepărtați supernatantul și repetați pasul 6.9 de încă două ori.
  11. Celulele din 1 ml de PBS. Treceți suspensiile celulare printr-un 100. m Site celular în pregătirea analizei citometrice în flux.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Acumularea de ASCS ridicat Sca1 din diferite tampoane de grăsime.

Celulele stromale vasculare izolate din grăsimea SQ prezintă forma celulelor alungite, asemănătoare fibroblastelor, indiferent de nivelul de expresie Sca1 (Figura 1A). Pe de altă parte, VIS (derivate din EWAT) celulele Sca1 ridicate și Sca1 joase prezintă diferențe marcate în forma celulei lor. La fel ca celulele înalte Sca1 SQ (derivate din iWAT), celulele înalte VIS (derivate din EWAT) Sca1 prezintă o formă celulară alungită, asemănătoare fibroblastului, în timp ce celulele scăzute VIS Sca1 prezintă formă epitelioidă. Celulele înalte SCA1 izolate de la șoareci SCA1-GFP sunt ușor identificate ca celule GFP-pozitive în cultura țesuturilor (1B) identificat. Când aceste celule au fost evaluate utilizând fluxul de citometrie, majoritatea celulelor GFP pozitive au fost confirmate că exprimă proteine ​​Sca1 pe suprafața celulei, așa cum a fost detectat cu un anticorp Ti-Sca1 (1C). Celulele Sca1 ridicate derivate din tampoane de grăsime inghinale mențin capacitatea adipocitelor - diferențierea crește, în timp ce celulele Sca1 derivate din EWAT sunt mai dificil de diferențiat cu amestecul adipogen convențional din adipocite.

Expresia genelor dependente de grăsime Expresia ASCS înaltă Sca1 (Figura 2).

Analizele transcriptomului la nivelul genomului cu secvențierea ARN au arătat îmbogățirea genelor în legătură cu proteinele și modificatorii matricei extracelulare (GO: 0.031.012, GO: 0005578) în aceste ASCS ridicate Sca1 10. În legătură cu analizele PCR în timp real, am putut detecta diferitele Exprimarea MMP colagenolitice (MMP-2, MMP8, MMP13, MMP14) între Sca1 derivat din iWAT și EWAT pentru a demonstra ASCS ridicat. Când s-au folosit geluri de colagen de tip I marcate cu fluorescență o pentru a evalua activitatea de degradare pericelulară, am observat activitatea crescută semnificativ de remodelare a colagenului mediată de VIS Sca1 ridicat ASCS 10.

imunomagnetică
Figura 1: Separarea imunomagnetică a Murine Sca1 ridicat ASCS din diferite depozite de grăsime (A) Sca1 high și Sca1 low ASCS izolate din SQ (iWAT) și VIS (EWAT). Scala = 100 µ m. (B) Celule Sca1-GFP izolate de iWAT de la șoareci Sca-GFP. Scala = 100 µ m. (C) Exprimarea suprafeței celulare a Sca1 în celulele Sca1-GFP-pozitive a fost evaluată folosind citometrie în flux. (Stânga) anticorpi anti-Sca1 IgG de șobolan (dreapta). Axa X, intensitatea GFP. Axa Y, Alexa-Fluor 647. Panoul A prezentat anterior în Tokunaga, M. și colab., (2014) .ig1large.jpg "target =" _ blank "> Vă rugăm să faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.

separarea
Figura 2:. Expresia dependentă de depozit de grăsimi a MMP colagenolitice, TIMP-uri și colageni (A) Exprimarea diferențială a genelor ECM și modificatorilor ECM în ASCS ridicat Sca1 izolat din diferite depozite de grăsime. (B) creșterea activității de degradare a colagenului VIS (derivat din EWAT) Sca1 ASCS ridicat. Defalcarea colagenului este prezentată ca dispariția semnalelor fluorescente (săgeți și vârfuri de săgeți). Inset este o imagine mărită a defalcării focalizate a colagenului mediată de o singură celulă din SQ ASCS. Celulele au fost cultivate timp de 72 de ore. Datele prezentate anterior în Tokunaga, M. și colab., (2014). Faceți clic aici pentru a VEDE o versiune mai mare a acestei figuri.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Aici arătăm izolarea și separarea celulelor imunomagnetice ale ASCS murin din diferite plăci de grăsime și utilizarea lor pentru experimentele in vitro. Metoda prezentată este eficientă pentru izolarea rapidă a unui număr mare de ASCS Sca1-pozitiv, ceea ce este avantajos față de izolarea tehnică complexă și costisitoare mediată de FACS a ASCS 9,14. Spre deosebire de FACS, separarea celulelor imunomagnetice nu permite utilizarea mai multor antigeni pentru a identifica o populație de celule țintă. Cu toate acestea, dacă antigenul de suprafață este bine caracterizat, utilizarea separării imunomagnetice mărește numărul de celule fără a se baza pe utilizarea dispozitivelor FACS 15, care încă nu este ușor disponibil la institutele mici fără facilități de bază pentru a analiza mulți cercetători biologici .

În timp ce Sca1 nu se găsește în genomul uman, identificarea și validarea antigenelor alternative de suprafață celulară pe celulele stem ale țesutului adipos uman dependent de depozit de grăsime s-au exprimat la 17, atunci când sunt asociate cu această tehnică de separare a celulelor, ne pot ajuta să definim biologia celulelor stem ale țesutului adipos uman.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Autorii nu au nimic de dezvăluit.

Mulțumiri

Această lucrare este susținută de NIH DK095137 (THC). Mulțumim actualilor și foștilor membri ai laboratorului care au contribuit la dezvoltarea și rafinarea procedurilor descrise.