Sindromul fenilcetonuriei materne Studiile la șoareci sugerează o posibilă abordare pentru unul

• subiecte
• abstract
• fundal
• Metode
• Rezultate
• Concluzie
• Principal
• Metode
• Revizuirea clinică retrospectivă a înregistrărilor
• Animale, îngrijire și proceduri
• Phe amoniac liază recombinantă PEGilată
• Testul Phe
• Analiza aminoacizilor
• Modelare farmacodinamică
• Rezultate
• PKU matern: Experiența Colegiului de Medicină al Universității din Florida
• Pegvaliase și mouse-ul PKU
• discuţie
• Informatii suplimentare
• Documente Word
• Informatii suplimentare
• Metode complementare
• Figura suplimentară S1
• Figura suplimentară S2
• Tabel suplimentar S1
• Fișiere Excel
• Tabelele suplimentare

subiecte

• Terapia biologică
• Sistemul endocrin și bolile metabolice
• Cercetări pediatrice
• Cursul sarcinii

abstract

fundal

Fenilcetonuria netratată (PKU), una dintre cele mai frecvente boli genetice la om, duce de obicei la dizabilități intelectuale. Deși nutriția artificială pe bază de proteine ​​poate preveni întârzierea, respectarea dietei este adesea slabă la adulți. La femeile gravide cu PKU, neconformitatea poate duce la sindromul PKU matern, în care nivelurile ridicate de fenilalanină (Phe) provoacă complicații fetale severe. Terapia de substituție enzimatică cu Phe amoniac lizază (PAL) corectează PKU la șoarecii mutanți BTBR Phe hidroxilază (Pah enu2), sugerând un posibil tratament pentru sindromul PKU matern la om.

Metode

Am analizat datele clinice pentru a evalua incidența sindromului PKU matern la femeile gravide PKU. Am tratat șoareci femele PKU (pe dietă normală) cu PAL, stabilizat Phe la niveluri fiziologice și le-am împerecheat pentru a evalua rezultatele sarcinii.

Rezultate

Dosarele medicale arată că eficacitatea dietei pentru prevenirea sindromului PKU matern nu s-a îmbunătățit din păcate în mod semnificativ, de când problema a apărut pentru prima oară acum 40 de ani. Tratamentul PAL al șoarecilor gravide PKU arată că descendenții mamelor tratate cu PAL supraviețuiesc până la vârsta adultă, spre deosebire de letalitatea totală observată la șoarecii netratați sau o rată de supraviețuire redusă la șoarecii din dieta PKU.

Concluzie

Tratamentul PAL a redus severitatea sindromului PKU matern la șoareci și poate avea potențialul de a efectua terapia PKU umană.

Fătul în curs de dezvoltare la mamele cu PKU slab controlat poate fi afectat negativ de expunerea intrauterină la niveluri crescute de Phe. Studiul colaborativ asupra fenilcetonuriei materne a constatat că nivelurile crescute de Phe din sângele matern sunt teratogene (5, 6, 7, 8, 9). Copiii cu sindrom PKU matern suferă de microcefalie, dismorfism craniofacial, greutate redusă la naștere, boli congenitale ale inimii, întârzieri în dezvoltare și dizabilități intelectuale (10, 11, 12). În 1980, 95% dintre mamele cu 524 de sarcini la 155 de femei cu concentrații de Phe în sânge ≥ 1.200 μM aveau cel puțin un copil cu dizabilități mintale (13). Incidența dizabilității intelectuale, a microcefaliei și a bolilor cardiace congenitale au fost mult mai frecvente decât la populația generală și corelate cu concentrațiile de Phe din sângele mamei.

Șoarecele PKU este un model stabilit pentru PKU uman și are caracteristici clinice similare cu cele la pacienții cu PKU, incluzând hiperfenilalanemie (concentrații plasmatice inițiale de Phe de 1.000 până la 2.000 μM), hipopigmentare, defecte cognitive, convulsii audiogene și sindromul PKU matern. (21, 22). . În studiile anterioare, o singură administrare subcutanată săptămânală de pegvaliase la doze de 80 mg/kg la șoareci masculi PKU a redus nivelurile plasmatice de Phe cu ≤ 1.200 μM la șoareci purtători enu2 (HET) și BTBR homozigot pe o perioadă de până la 10 luni - Șoarecii mutanți Pahenu2 (PKU) (21) provin din Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Toate protocoalele au fost aprobate de Universitatea din Florida IACUC. Șoarecii au fost reținuți pentru tratamentul cu pegvaliase și pegvaliase a fost injectat subcutanat în regiunea superioară a spatelui și a gâtului inferior. Plasma Phe a fost obținut dintr-un 45. l probă de sânge colectată într-un tub microcapilar heparinizat.

Phe amoniac liaza recombinantă PEGilată

O formă recombinantă PEGilată de Anabaena variabilis pegvaliase a fost furnizată de BioMarin Pharmaceutical (Novato, CA). O soluție sterilă de 10 mg/ml (

12 UI/ml) pegvaliase a fost diluată săptămânal la 5 mg/ml și păstrată la 0 ° C. În funcție de doza dorită, alicote au fost diluate la 0,5-2,0 mg/ml și injectate 10 μl/g greutate corporală.

Testul Phe

Plasma Phe a fost determinată folosind o analiză fluorometrică (24) care a fost modificată extensiv pentru volume mici, timpii de răspuns rapid și formatul plăcii de microtitrare. Plasma din probele de sânge a fost înghețată până la testare. O alicotă (7,5 pl) din fiecare probă de plasmă a fost eliberată de proteine, plasată într-o placă PCR cu 96 de godeuri cu cocktail de testare și incubată timp de 2 ore la 60 ° C. Reactivul de cupru a fost adăugat la fiecare godeu al unei plăci fluorimetrice negre de 0,5 ml cu 96 de godeuri (Nunc, Roskilde, Danemarca, critică pentru determinarea precisă a Phe plasmatic) și probele de plasmă incubate au fost adăugate. Placa era pe un cititor de plăci SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) cu parametri de excitație: 378 nm; Emisie: 512 nm.

Analiza aminoacizilor

Aminoacizii și standardele unice (Sigma) și reactivii de cromatografie lichidă de înaltă performanță (Fisher) au fost obținuți de la Sigma Chemical (St. Louis, MO) și Fisher Scientific (Atlanta, GA). Probele de plasmă au fost deproteinizate și norleucina a fost adăugată ca standard intern. Probele uscate au fost derivatizate cu feniltiocarbamil, uscate sub vid, exces de reactiv îndepărtat și cromatografiate pe un Beckman System Gold LC cu detector UV-VIS (254 nm) și o coloană analitică Phenomenex cu fază inversă C18. Concentrațiile de aminoacizi au fost calculate utilizând suprafețele de vârf standard/intern comparativ cu suprafețele de vârf ale eșantionului.

Modelare farmacodinamică

Parametrii farmacocinetici au fost determinați din studii farmacocinetice/farmacodinamice cu doză unică (Musson și Laipis, date neprezentate) la șoareci naivi. Probele de plasmă au fost analizate pentru nivelurile de pegvaliase de către BioMarin Pharmaceutical utilizând o analiză imunosorbentă legată de enzimă sandwich specifică pegvaliasei. Pegvaliaza legată a fost detectată cu un anticorp anti-PEG. Limita de cuantificare a fost de 60 ng/ml. Nivelurile de Phe plasmatic au fost determinate așa cum s-a descris mai sus. Concentrațiile plasmatice de Phe plasmatică la diferite regimuri de dozare pegvaliase au fost modelate utilizând versiunea 5.2 a software-ului WinNonlin (Certara, Princeton, NJ, SUA).

Rezultate

PKU matern: Experiența Colegiului de Medicină al Universității din Florida

Universitatea din Florida, Colegiul de Medicină, Departamentul de Pediatrie, Departamentul de Genetică Clinică și Metabolism, servește regiunea Florida de Nord de la Pensacola la Jacksonville până la Orlando. Este un centru medical universitar care tratează majoritatea pacienților cu PKU din zonă pentru tulburarea lor. Femeile gravide PKU primesc consiliere prenatală și terapie nutrițională intensivă din cauza riscurilor pentru făt. Deși distanța până la centru face ca vizitele regulate să fie incomode pentru mulți pacienți, aceștia sunt în permanență sfătuiți cu privire la dietă și li se cere să prezinte săptămânal valorile Phe din sânge și greutățile corporale. Recomandările noastre pentru femeile gravide (și probabil însărcinate) cu PKU sunt să mențină nivelurile de Phe din sânge între 120 și 240 μM și Tyr peste 50 μM, să adere la aportul de nutrienți recomandat pentru sarcină și să promoveze creșterea în greutate adecvată.

Am examinat retrospectiv înregistrările a 28 de sarcini între 1996 și 2010. Pacienții au fost împărțiți în trei grupe:

Grupa 1: Control Phe excelent (3/28) - Valorile medii ale Phe în sânge în timpul sarcinii au fost sub 360 μM, cu valori maxime sub 420 μM Phe în orice moment și timp de cel puțin șase valori Phe înregistrate în primul trimestru.

Grupa 2: Controlul Phe borderline (11/28) - Nivelurile medii de Phe din sânge au fost sub 420 µ în primul trimestru. M și apoi în al doilea și al treilea trimestru, în medie sub 360 µ. M. Pacienți cu o valoare Phe plasmatică inițială de 700 μM sau mai mică în primul trimestru și două sau mai puține valori peste 500 μM în restul sarcinii.

Grupa 3: Controlul Phe neadecvat (14/28) - nivelurile plasmatice medii de Phe au fost peste 420 μM în primul trimestru, cu medii peste 360 ​​μM în restul sarcinii și/sau cu valori multiple peste 420 μM.

Valorile medii ale Phe în cele 40 de săptămâni de sarcină pentru cele trei cohorte de pacienți sunt prezentate în figura suplimentară online S1. Rezultatul fiecărei sarcini, clasificat ca normal sau afectat, pe baza parametrilor nașterii (greutate, înălțime, circumferința capului), a datelor disponibile la examenul clinic și a prezenței afecțiunilor legate de sindromul PKU matern, este rezumat în tabelul suplimentar S1. Există diferențe semnificative între grupuri (valoarea absolută Phe, nivelul de control atins, valorile maxime Phe înregistrate în timpul fiecărui interval de timp și rezultatele sarcinii); O descriere detaliată a fiecărui grup poate fi găsită în fișierul „Rezultat clinic suplimentar”.

Pegvaliase și mouse-ul PKU

Pentru a evalua beneficiul terapeutic potențial al pegvaliasei în tratarea femeilor însărcinate cu PKU și a fetușilor acestora cu risc de PKU maternă, am examinat efectele acestuia asupra sindromului PKU matern la șoarecii PKU femele utilizând diferite doze și regimuri de tratament. Rezultatele studiilor noastre sunt rezumate în Tabelul 1; Rezultatele detaliate pentru fiecare studiu sunt prezentate în tabelul suplimentar S2. Observăm aici că sindromul PKU matern este semnificativ mai sever la șoarecele PKU decât la pacienții cu PKU uman. Moartea completă a nou-născutului în primele 24 de ore de viață este rezultatul obișnuit (21). În plus, deși o dietă cu restricție Phe poate corecta parțial sindromul matern PKU la șoarecii PKU, puțini pui supraviețuiesc înțărcării cu o dietă săracă în Phe (21).

50 g, iar aportul de alimente va fi mai mult decât dublu. Aportul alimentar revine la normal după naștere, dar crește din nou în timpul alăptării, deoarece mama care alăptează hrănește 40 - 50g de pui la 14 zile după naștere, când puii încep să încerce alimente solide. Acești factori au indicat faptul că programele de administrare de două ori pe săptămână utilizate la șoarecii adulți care nu sunt însărcinate nu au reușit să mențină în mod adecvat niveluri stabile de Phe plasmatic fiziologic în timpul sarcinii.

Inițial, am bănuit că nivelurile de Phe plasmatic matern din studiul 08-005 ar fi putut atinge valori extreme care erau atât prea scăzute, cât și prea mari pentru supraviețuirea puilor, cum ar fi studiul privind dieta restricționată Phe și studiul scurt pegvaliase. Timp de înjumătățire (21, 23). În consecință, opt șoareci femele PKU (Studiul 08-027) au fost tratați secvențial cu protocoale pegvaliase dezvoltate prin modelare farmacodinamică pentru a produce niveluri medii de Phe plasmatic de 250 µg. M la 4 u M (Tabelul 1 și tabelul suplimentar S2). Deși protocolul final (luni, miercuri, 10 mg/kg; vineri, 20 mg/kg) a avut ca rezultat o stare fizică excelentă și o durată de viață crescută, dimensiunea așternutului și numărul puilor vii au crescut doar ușor (dimensiunea medie a așternutului 6 (2 litere) din 10) pui la naștere); 32% dintre puii înțărcați însărcinați) au fost văzuți. Aceste femele erau semnificativ mai în vârstă la momentul împerecherii datorită ajustărilor de protocol necesare pentru a atinge nivelul dorit de Phe plasmatic de 4 PM (Tabelul 1).

Într-un al treilea studiu (09-068a), 12 șoareci femele PKU au fost tratați cu un regim de dozare ușor diferit (10 mg/kg pegvaliase, luni, 8:00; miercuri, vineri, 16:00), prin care modelarea farmacodinamică a dus și la o plasmă uniformă Phe ar trebui să asigure controlul (Figura 1 și Tabelul 1). În plus, probele de plasmă au fost prelevate la ora 8 în loc de ora 16 Acești 12 șoareci PKU au avut în medie 300 pg. Nivelul M Phe la 4 µ M, indicând un control bun al nivelurilor de Phe în timpul săptămânii, așa cum s-a prezis prin modelarea farmacodinamică. Cu toate acestea, valorile din probele de sânge 8-AM au fost crescute dramatic (Figura 1). Aceste femei au fost împerecheate în timpul acestui protocol de dozare și au avut un total de 39 de sarcini (Tabelul 1, Tabelul suplimentar S2). Puțin peste 50% din aceste sarcini au cățeluși înțărcați, cu o dimensiune medie a așternutului de aproximativ șase cățeluși (cinci litere din opt sau mai mulți cățeluși), ceea ce este mai bun decât rezultatele anterioare.

Variația zilnică a nivelurilor de fenilalanină plasmatică (Phe) la șoareci cu fenilcetonurie (PKU) tratați cu pegvaliase. Doisprezece șoareci femele PKU (Studiul 09-068a) au fost injectați subcutanat cu 10 mg/kg pegvaliase de trei ori pe săptămână (luni, 8:00; miercuri, 16:00; vineri, 16:00; ↓). Modelarea farmacodinamică a acestui plan de dozare (▪▪▪▪) a prezis o bună reglare a nivelurilor plasmatice de Phe. Probele de sânge (40 ul) au fost prelevate la 8:00 a.m. și 4:00 p.m. în diferite zile ale săptămânii pe o perioadă de 7 săptămâni, iar nivelurile plasmafei au fost calculate în medie pentru a obține un grafic compozit săptămânal al nivelului de plasmaphe (O). Marcajele principale de hash pentru axa x reprezintă zilele săptămânii (12:00 p.m.) și marcajele hash secundare pentru 8:00 a.m. și 4:00 p.m. Datele compuse de la șoareci femele PKU netratate (2, •) au fost repetate de șapte ori pentru a arăta acordul maxim cu datele Phe plasmatice săptămânale din tratamentul cu pegvaliase. Vârfurile plasmatice ale Phe apar la animalele tratate în momente care corespund nivelurilor maxime de Phe plasmatic la șoarecii PKU netratați, deși o reducere marcată a valorilor Phe plasmatice 8-AM în zilele după administrarea unei pegvaliase Se observă doza.

Variația zilnică a nivelurilor de fenilalanină plasmatică (Phe) la șoarecii fenilcetonurie femele netratate (PKU). Modificarea nivelurilor de Phe plasmatică care a avut loc în timpul ciclului de 24 de ore de lumină întunecată a fost determinată din analiza datelor compozite. Probele de sânge (40 μl) au fost prelevate de la șase șoareci femele adulți PKU la orele indicate, probele fiind prelevate pe o perioadă de 9 săptămâni pentru a evita stresul din cauza pierderii de sânge. Au fost prelevate două probe de la fiecare animal la fiecare moment. Rezultatele Phe din plasmă au fost combinate și mediate pentru a da înregistrarea de date compuse de 24 de ore. Graficul arată creșterea rapidă de peste 1.000 μM în plasma Phe care a avut loc atunci când șoarecii s-au trezit la 6 p.m. și au început să se hrănească, iar scăderea mai lentă de la începutul ciclului de lumină la 6 a.m.

Un alt factor ar putea influența tratamentul sindromului matern PKU cu pegvaliase. La PKU umană netratată, raportul dintre Tyr și Phe este adesea redus, nivelurile plasmatice observate de Tyr fiind reduse la 50% din valorile observate în controalele normale (25). Am măsurat nivelurile de Trp, Tyr și Phe în șoareci PKU tratați cu WT, PKU și pegvaliase prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (Figura 4). Ca și la pacienții umani cu PKU, nivelurile plasmatice de Tyr la șoarecii PKU au fost reduse față de nivelurile normale, fără nicio modificare a nivelurilor de Trp. Scăderea nivelului Phe plasmatic de PKU la niveluri fiziologice sau subfiziologice prin pegvaliase nu a avut niciun efect asupra plasmei Tyr. Încercările de a crește nivelul Tyr la șoarecele PKU tratat cu pegvaliase prin adăugarea lui Tyr în apa potabilă nu au avut succes din cauza solubilității sale slabe. Prin urmare, utilizarea unei diete artificiale cu Tyr adăugat (în cazul în care solubilitatea scăzută nu limitează absorbția potențială) este necesară pentru a determina rolul posibil al Tyr scăzut în răspunsul parțial al sindromului PKU matern la șoarece PKU.

Niveluri de aminoacizi aromatici în plasmă la șoareci femele de tip sălbatic (WT) și fenilcetonurie (PKU). Probele de plasmă obținute de la șoareci WT și PKU netratați și șoareci tratați cu pegvaliase au fost analizate prin separare prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Probele de plasmă de la șoareci PKU netratați prezintă un nivel plasmatic crescut semnificativ de fenilalanină și un nivel plasmatic mai mic de tirozină cu 40-50% comparativ cu șoarecii WT. Nivelurile plasmatice ale triptofanului au rămas similare între cele două genotipuri. Tratamentul cu pegvaliase a scăzut Phe plasmatic la valori fiziologice sau sub valori fiziologice normale, în funcție de regimul de dozare. Nivelurile de tirozină și triptofan la șoarecii PKU netratați și tratați cu pegvaliase au fost similare.

discuţie

---