Studii biologice comportamentale farmacologice și moleculare privind retragerea opiaceelor la șobolani -
Studii biologice comportamentale farmacologice și moleculare privind retragerea opiaceelor la șobolani Disertație a Facultății de Biologie a Universității Ludwig Maximilian din München Institutul Zoologic Departamentul de Neurobiologie prezentată de Dipl.-Biol. Christian Kirschke la 31 octombrie 2001
Primul raport: Al doilea raport: Raport special: Prof. Dr. Rainer Landgraf Prof. Dr. Peter Schlegel Prof. Dr. Ziua examenului oral Rainer Spanagel: 17 iunie 2002
Cuprins 1. Introducere generală 3 2.1. Introducere [S 35] -GTPγS studiu de autoradiografie 11 2.2. Material și metode [S 35] -GTPγS studiu de autoradiografie 17 2.2.1. Animale și creșterea animalelor 17 2.2.2. Procedura de testare și proiectarea grupului 17 Experiment 1 17 Experiment 2 18 Experiment 3 19 2.2.3. Selecția zonelor cerebrale 19 2.2.4. [S 35] -GTPγS autoradiografie 21 2.2.5. [H 3] -DAMGO studiu de legare 22 2.2.6. Evaluare și statistici 23 2.3. Rezultate [S 35] -GTPγS studiu de autoradiografie 25 Experiment 1 25 Experiment 2 31 Experiment 3 35 2.4. Discuție [S 35] -GTPγS studiu de autoradiografie 37 3.1. Introducere în conceptul de doză mică de naloxonă 42 3.2. Material și metode Concept de naloxonă cu doză mică 46 3.2.1 Animale și creșterea animalelor 46 3.2.2 Pelete de morfină 46 3.2.3. Experimente în câmp deschis 47 Administrarea dozei mici de naloxonă acută 47 Sensibilizare 48 3.2.4. Experimente în cutii Skinner 49 discriminare de droguri 49 Retragerea opiaceelor în cutii Skinner 50 3.2.5. Experiment în casete de observare 51 3.2.6. Evaluare și statistici 52 3.3. Rezultatele conceptului de naloxonă cu doză mică 54 Pelete de morfină 54 Experimente în câmp deschis 55 Experimente în cutii Skinner 58 Experimente în cutii de observare 61 3.4. Discutarea conceptului de doză mică de naloxonă 63
4.1. Inducerea retragerii condiționate 68 4.2. Material și metode de retragere condiționată 74 4.2.1 Animale și creșterea animalelor 74 4.2.2. Model animal de retragere condiționată 75 4.2.3. Experiment în câmp deschis 77 4.2.4. Test pentru hiperalgezie (placă fierbinte) 77 4.2.5. Măsurarea hormonilor de stres 77 4.2.6. Compararea modelului animal cu paradigma stresului 78 4.2.7. hibridizare in situ 79 4.2.8. Intervenția prin memantină 82 4.2.9. Evaluare și statistici 82 4.3. Rezultatele sevrajului condiționat 83 Partea 1: Model animal pentru măsurarea simptomelor de sevraj condiționate 83 Partea 2: hibridizare in situ 96 Partea 3: Intervenție farmacologică utilizând memantină 99 4.4. Discuția despre retragerea condiționată 106 Partea 1: Model animal pentru măsurarea simptomelor de sevraj condiționate 106 Partea 2: Hibridizare in situ 109 Partea 3: Intervenție farmacologică utilizând memantina 111 5. Concluzie 113 6. Bibliografie 116 Mulțumiri 131 Curriculum vitae 132
Încă nu există cunoștințe despre activitatea proteinelor G cuplate cu receptorul μ-opioid în retragere, astfel încât întrebarea cu privire la măsura în care activitatea neuronală excesivă în retragere este influențată de proteinele G și funcționalitatea acestora nu a fost clarificată. Scopul acestui studiu este, prin urmare, de a investiga activitatea proteinelor G cuplate cu receptorul µ-opioid în retragere, ținând cont de diverși parametri. Metoda de investigare este cea a lui Sim și colab. (1995) au dezvoltat în continuare autoradiografia [S 35] -GTPγS, care face posibilă efectuarea acestei măsurători de activitate pe secțiunea în mare parte intactă a creierului și, în același timp, pentru a determina o localizare anatomică exactă a acestei activități. Acest lucru face, de asemenea, posibilă efectuarea unor metode suplimentare de examinare biologică moleculară (de exemplu, un studiu de legare a ligandului) pe același creier, pentru a detecta orice diferențe în interacțiunea dintre legarea receptorilor și activarea proteinei G. 16
10 10 +5 +5 0 0 -5 -5 -10 -15 -10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0 -5 +15 +10 +5 0 -5 Nucleus accumbens Interaural 10,60 mm Bregma 1,60 mm 10 10 +5 +5 0 0 -5 -5 -10 -15-10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0-5 +15 +10 +5 0-5 LV Nucleul central al amigdalei II Interaural 6,70 mm Bregma -2,30 mm 10 10 +5 +5 0 0-5 -5-10 -15-10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0-5 +15 +10 +5 0-5 Locus coeruleus Nucleus parabrachialis Interaural -0.80 mm Bregma -9.80 mm Fig. 4: Ilustrarea și poziția zonelor cerebrale examinate. Reprezentare modificată din Paxinos și Watson (1998) 20
2.2.6. Evaluare și statistici Evaluarea autoradiografiei și statisticilor [S 35] -GTPγS: Filmele dezvoltate au fost digitalizate cu ajutorul unei camere video (Sony XC-77) și evaluate cu ajutorul unui computer (Optimas, BioScan). Gradul de înnegrire a regiunilor cerebrale individuale a fost înregistrat prin densitometrie, iar radioactivitatea [S 35] a fost determinată prin compararea unui standard aplicat [C 14] (NEN) și a unui factor de conversie calculat. Rezultatul a fost exprimat în nci/g. Factorul de conversie a fost calculat prin îndepărtarea secțiunilor incubate de pe lamele, determinarea greutății și determinarea radioactivității într-o fotometrie de scintilator lichid. Un factor de conversie a fost calculat din nivelurile de gri și standardul [C 14] aplicat pe baza rezultatelor spectrofotometriei cu scintilator lichid. Datele obținute au fost exprimate ca medie de grup ± eroare standard (SEM). Calculele statistice au fost efectuate utilizând o analiză a varianței cu doi factori (ANOVA, factor A: măsurare bazală de stimulare versus stimulare DAMGO, factor B: grupuri). Testul Newman-Keuls a fost folosit ca test post hoc ulterior. Dacă probabilitatea de eroare p