Studii și rapoarte de conferințe ale Agenției de Stat pentru Mediu
Studii și rapoarte de conferințe ale Agenției de Stat pentru Mediu Volumul 49 Influența pesticidelor asupra reproducerii și larvele amfibienilor
Studii și rapoarte de conferință Volumul 49 Influența pesticidelor asupra reproducerii și larvele amfibienilor folosind exemplul unui erbicid (izoproturon) și a unui insecticid (cipermetrin)
5.1.2 Parametrii apei 27 5.1.3 Spectrul amfibian 27 5.2 Absorbția celor 14 substanțe marcate cu C 28 5.2.1 Absorbția în reproducere 28 5.2.1.1 Isoproturon 28 5.2.1.2 Cypermetrin 28 5.2.2 Cinetica absorbției în larve 29 5.2.2.1 Isoproturon 29 5.2.2.2 Cipermetrină 29 5.2.3 Metaboliți ai izoproturonului 30 5.3 Toxicitate 31 5.3.1 Ratele de eclozare și teratogenitate 31 5.3.1.1 Isoproturon 31 5.3.1.2 α-cipermetrină 31 5.3.2 Afectarea larvelor 31 5.3.2.1 Isoproturon și produs comercial TOLKAN FLO 31 5.3.2.2 α-cipermetrină 32 5.3.3 Sensibilitatea anumitor faze de dezvoltare 32 5.3.3.1 Isoproturon 32 5.3.3.2 α-cipermetrină 33 5.4 Biotransformare 34 5.4.1 Isoproturon 34 5.4.1.1 Ingredient activ pur 34 5.4.1.2 Produse comerciale 35 5.4.1.2. 1 TOLKAN FLO 35 5.4.1.2.2 FENIKAN 36 5.4.2 Cipermetrină 37 5.4.2.1 Ingrediente active 37 5.4.2.1.1 Cipermetrină 37 5.4.2.1.2 α-cipermetrină 39 5.4.2.2 Produs comercial 40 5.4.2.2.1 FASTAC SC 40 6 Discuție 41 6.1 Studii de teren 41 6.2 Ingerarea ingredientelor active ale pesticidelor ffe 42 6.3 Toxicitate 43 6.4 Biotransformare 46 6.4.1 Isoproturon 46 6.4.2 Cipermetrină 49 6.5 Considerații energetice 51 6.6 Management 52 7 Concluzii 54 8 Literatură 56 Publicații I-IV 64 CUPRINS 3
Fig. 3: Structura chimică a celor 8 stereoizomeri ai cipermetrinei. α-cipermetrina este un racemat al celor doi izomeri cis în cutie. Viteza mai mare de aplicare a cipermetrinei (100 g/ha), de exemplu, a dus la o concentrație de ingredient activ de 100 µg/l măsurată la 4 ore după pulverizarea unor corpuri mici de apă la o adâncime a apei de 2,5-10,0 cm (CROSSLAND, 1982). Imediat după aplicare, 24 mg/l cipermetrină a fost detectată în pelicula de suprafață extrem de subțire (0,05 mm); în decurs de o săptămână, valorile au scăzut la 50 µg/l. În prima oră după aplicarea terestră a cipermetrinei într-o vie, 0,2 până la 1,7 µg/l cipermetrină a fost găsită într-un șanț adiacent, direct sub suprafața apei (BENNETT și colab., 1980). Nu s-au observat anomalii comportamentale sau efecte letale la populațiile de pești și amfibieni din zona liberă. INTRODUCERE 11
Fig. 4: Posibil prim pas în metabolismul cipermetrinei prin scindarea legăturii ester Există, de asemenea, indicații ale biotransformării cipermetrinei prin conjugare la glutation (faza II) după oxidarea anterioară de către grupurile enzimatice monooxigenază dependente de citocromul P-450 din faza I (DAVIES) și colab., 1994). GST omniprezent este capabil să catalizeze conjugarea unei varietăți de componente electrofile, inclusiv erbicide și insecticide, la glutation (HAYES & WOLF, 1988; BUCCIARELLI și colab., 1999; GLÄßGEN și colab., 1999), demonstrând varietatea Isoenzime ilustrate. Majoritatea izoenzimelor GST sunt dizolvate în citosol (așa-numitele). O GST legată de membrană (mgst) ar putea fi izolată din țesutul hepatic al diferitelor mamifere (de exemplu șobolani; DEJONG și colab., 1988) și, de asemenea, din ficatul broaștei cu gheare (SUN și colab., 1998). Izoenzimele citosolice sunt împărțite în cel puțin șase clase diferite datorită secvențelor de aminoacizi similare și specificităților substratului: α, µ, π, θ, ζ și σ (EATON & BAMMLER, 1999). Comparativ cu GST la mamifere, se știe relativ puțin despre amfibieni (BUCCIARELLI și colab., 1999). Investigațiile anterioare au vizat izolarea și identificarea diferitelor izoenzime GST la amfibieni (DI ILIO și colab., 1992; GRUNDY & STOREY, 1998). O modificare a modelului GST la amfibieni între stadiul embrionar și adult a fost descrisă pentru Bufo bufo; anumite izoenzime aparținând clasei π din etapele ulterioare ale dezvoltării (bbgst P2-2) păreau a fi mai eficiente împotriva efectelor toxice ale metaboliților reactivi ai xenobioticelor (BUCCIARELLI și colab., 1999). Prin urmare, în cadrul lucrării prezentate aici, ar trebui investigate efectele expunerii la pesticide asupra activității GST în diferite etape de dezvoltare a amfibienilor. 3.4 Organisme de testare Testul FETAX (testul teratogenezei embrionului broască-testul Xenopus; DAWSON & BANTLE, 1987) este utilizat în prezent ca instrument standardizat pentru investigarea unui număr mare de procese biologice în 14 INTRODUCERE
4 Material și metode 4.1 Material 4.1.1 Echipament Echipament HPLC cu detector de matrice de diode 996 Coloană LiChrospher 100 RP-18 (250 x 4 mm; 5 µm) coloană de protecție (4 x 4 mm) Coloană Sferisorb ODS (250 x 4,6 mm; 2, 5 µm) HPLC cu contor de scintilație de sticlă [14 C] yttrium Coloană Sferisorb ODSII (250 x 4,6 mm; 3 µm) conductivitate contor pH-metru rotor 70,1 contor de oxigen contor de scintilație LSC 1900 TR contor de scintilație 1409 Sep-Pak coloane de extracție spectrofotometru Uvikon 922 ultracentrifugare Optima Fotometru L-60 PT-3 Fotometru Producător Waters Merck Merck Sykam Shimadzu Berthold Merck WTW WTW Beckman WTW Packard Wallac Waters Kontron Beckman Macherey & Nagel Uvicon 4.1.2 Radiochimice Denumire chimică Activitate specifică Vânzări 14C- IPU 3- (4-izopropil- [14 C] -fenil) - 3,965 MBq/mg Izotop internațional 1,1-dimetiluree Puritate> 97% Germania 14C- Cipermetrin R-ciano-3-fenoxibenzil (1R) - 4,625 MBq/mg Izotop internațional cis-3 (2,2- diclorovinil) -2,2- puritate> 95% Germania dim etil [14 C] ciclopropan carboxilat 18 MATERIAL ȘI METODE
4.1.3 Produse chimice Denumire chimică Vânzări α-cipermetrină R-ciano-3-fenoxibenzil (1R) -cis-3 (2,2-diclorovinil) - Fluka 2,2-dimetilciclopropancarboxilat Reactiv Bradford Sigma Brij-35 polioxietilen lauril eter Fluka CaCl 2 clorură de calciu Merck CDNB 1-cloro-2,4-dinitrobenzen Fluka CH 3 CN acetonitril Roth CH 3 OH metanol Roth cipermetrină R-ciano-3-fenoxibenzil (1R) -cis-3 (2,2-diclorovinil) - Fluka 2,2-dimetilciclopropancarboxilat DCNB 2,4-dicloro-1-nitrobenzen Fluka Diflufenikan Fluka DTE Dithioerythritol Sigma EDTA Acid etilendiaminetetraacetic Sigma FASTAC SC BASF FENIKAN Bayer Fluorodifen 4-Nitrofenil-2,2-nitrofluor-metilfenileter Fluka Glicerol-Sigma GSH -1,1-dimetilurea Sare de mare Fluka Aquarienhandel Na 2 HPO 4 hidrogen fosfat disodic Sigma NaH 2 PO 4 Sodiu dihidrogen fosfat Sigma NaHCO 3 Sodiu hidrogen carbonat Merck NAP-10 Sephadex G-25 coloane Amersham-Pharmacia TOLKAN FLO Bayer 4.1.4 Buffer tampon de separare: tampon sodiu r, 0,1 M, ph 6,5 tampon microsom: tampon fosfat de sodiu, 20 mm, ph 7,0 20% glicerol 1,4 mm DTE 1 mm EDTA 20% glicerol 1,4 mm tampon citosol DTE: tampon fosfat de sodiu, 20 mm, ph 7, 0 MATERIAL ȘI METODE 19
Pe parcursul cursului, conținutul de substanță radioactivă din larve a scăzut din nou semnificativ, după 24 de ore de expunere a ajuns la 59,12 ± 1,62 ng cipermetrină/mg greutate proaspătă aproape valorile martorului (53,65 ± 3,31 ng cipermetrină/mg greutate proaspătă) și a rămas constantă (Fig. 10). În larvele de R. arvalis, s-a înregistrat o captare rapidă și eliminarea ulterioară a cipermetrinei marcate cu 14 C. În faza de eliminare, a fost măsurată o creștere a conținutului de compuși de carbon marcați radioactiv în mediu, care trebuie să fie neconvertit cipermetrina marcată cu 14 C și/sau metaboliții săi. 5.2.3 Metaboliții izoproturonului Prin compararea timpilor de retenție a celor 14 metaboliți marcați de B. bombina și B. variegata cu cei din standardele inițiale, mai mulți metaboliți ai UIP ar putea fi detectați la ambele specii, cum ar fi derivatul N-demetilat MDM-IPU, derivații C-hidroxilați 1-OH-IPU, 2-OH-IPU, 1-OH-MDM-IPU și 2-OH-MDM-IPU și metabolitul olefinic izopropenil-IPU (Fig. 11, Publ. I). Fig. 11: Schema de metabolizare a izoproturonului conform HAAS (1997) Metaboliții din cutie au fost detectați în studiul prezentat aici. 30 REZULTATE
8) Pentru cultivarea zonelor agricole în centrele de distribuție a speciilor sensibile de amfibieni, sunt necesare metode de producție mai ecologice. Pe lângă favorizarea protecției integrate a plantelor și utilizarea tehnologiei de reducere a derivei, se recomandă stabilirea de benzi tampon crescute în jurul corpului de apă (cu o lățime minimă de 20 m). Agenda 2000 oferă instrumente pentru plăți compensatorii în zonele afectate de restricții de mediu. CONCLUZII 55
Abrevieri 1-OH-IPU 1-Hidroxi-IPU 1-OH-MDM-IPU 1-Hidroxi-Monodesmetil-IPU 2-OH-IPU 2-Hidroxi-IPU 2-OH-MDM-IPU 2-Hidroxi-Monodesmetil-IPU B bombina Bombina bombina B. variegata Bombina variegata BCF factor de bioconcentrare BSA ser albumină bovină, fracțiunea V CDNB 1-cloro-2,4-dinitrobenzen; Substrat fotometru CP citosol tampon CPA acid ciclopropancarboxilic DCNB 2,4-dicloro-1-nitrobenzen; Substrat fotometru DTE Dithioerytrithol FFH Fauna-Flora-Habitat GSH Glutation GST Glutathione S-Transferase HPLC High Pressure Liquid Chromatography IPU Isoproturon kat Katal, unitate pentru activitatea enzimei KO/W Coeficient de partiție octanol/apă MDM-IPU Monodesmetil-IPU mgst microsom Tampon microsom NaP tampon fosfat de sodiu PBA acid fenoxibenzenic R. arvalis Rana arvalis așa-numita glutation solubil S-transferază 62