TEZĂ DE DIPLOMĂ. Activitatea biologică a unui derivat de acid tiocarbonic nou sintetizat (MAH4 HCl) pe organe izolate de la cobai

1 TEZĂ DE DIPLOMĂ Activitatea biologică a unui derivat de acid tiocarbonic nou sintetizat (MAH4 HCl) pe organe izolate de la cobai Autor Özlem Çetinkaya Grad academic dorit Magistra der Pharmazie (Mag.pharm.) Viena, 2012 Numărul studiului conform fișei de studiu: A 449 Domeniul de studiu conform fișei de studiu: A 449 Ao. Prof. univ. Dr. Christian Studenik

2 Pentru familia mea și Bernhard

3 Mulțumiri În primul rând aș dori să le mulțumesc părinților mei Firdes și Mehmet Çetinkaya, fraților mei Eylem, Eylen, Özden și Murat, precum și logodnicului meu Bernhard, care a stat în spatele meu în timpul întregului studiu. Cu supervizorul meu Ao. Prof. univ. Dr. Îi mulțumesc din suflet lui Christian Studenik pentru impulsurile valoroase și pentru sprijinul mare, uman și competent. Aș dori, de asemenea, să-i mulțumesc domnului Ao. Prof. univ. Dr. Thomas Erker și grupul de lucru al Departamentului de chimie medicală/farmaceutică pentru furnizarea substanței de testat. Aș dori, de asemenea, să le mulțumesc din toată inima prietenilor mei Alma Seydinovic, Milada Avdic și Hamdi Canan pentru sprijinul lor activ. Cu ei, învățarea în biblioteca AKH a fost mult mai distractivă. Ai fost mereu alături de mine în vremuri bune și rele și vei avea întotdeauna un loc minunat în inima mea. Aș dori apoi să le mulțumesc socrilor mei, Mastal, pentru sprijinul lor deosebit în corectarea tezei.

4 Cuprins 1 Introducere Hipertensiunea cardiacă Hidrogen sulfurat Obiective Material și metodologie Substanță de testare MAH4 HCl Solvent Animale experimentale Soluție electrolitică fiziologică Organe utilizate Materialele de preparare utilizate Atriul drept Artera pulmonară Musculul papilar (Musculus papillaris) Intestinul subțire (Ileum terminalis) Aorta (aparat) Carbogen efectuarea experimentelor Efectul substanțelor asupra organelor izolate ale cobaiului Atrium Dexter (atriul drept) Musculus papilar (mușchiul papilar) Ileonul terminal (intestinul subțire) Aorta artera pulmonară descendentă (artera pulmonară)

5 3.6.2 Investigații ale mecanismului de acțiune al DAPP 4HCL în intestin Investigații cu glibenclamidă și nitro-L-arginină Evaluarea datelor și statisticilor Atrium dexter Musculus papillaris Aorta, Arteria pulmonalis, Terminalis ileum Rezultate statistice Rezultate ale substanței de testare DAP 4HCl Atrium cordis dexter Musculus papillaris descendens arterial pulmonary terminal ileum Investigarea mecanismului de acțiune al substanței de testat MAH4 HCl asupra intestinului Efectul MAH4 HCl în combinație cu NO-L-arginină asupra intestinului Efectul MAH4 HCl în combinație cu glibenclamidă pe intestin Rezumatul discuției Bibliografie Curriculum Vitae

15 3 Material și metodologie 3.1 Substanță de testat Substanța de testat a fost testată la Facultatea de Științe ale Vieții de la Departamentul de Chimie Medicinală/Farmaceutică de către Ao. Univ. Prof. Dr. Thomas Erker nou sintetizat și pus la dispoziție pentru testarea MAH4 HCI Figura 1: Structura chimică a MAH4 HCl MG: 297,89 g/mol octil [2- (dimetilamino) etoxi] clorhidrat de metanioat 10

16 3.1.2 Solvent Pentru a realiza experimentele, substanța a trebuit să fie complet dizolvată într-un solvent adecvat în prealabil. MAH4 HCI a fost foarte rapid și complet în dist. Solubil în apă. Greutatea inițială a fost întotdeauna aleasă astfel încât o concentrație de 100 umol/l în vas să fie atinsă în băile de organe după adăugarea completă, cumulativă. Băile de organe disponibile au fost de 8 ml și 25 ml. Calcul: MG/4/100 = calcul pentru vasul mare MG/12,5/100 = calcul pentru vasul mic Tabelul 2 prezintă soluțiile stoc calculate și utilizate: Tabelul 2: Soluții stoc Substanță Masă molară MAH4 HCl 297,89 g/volum de mol de baie de organe în greutatea inițială a substanței de testat (100 μmol/l)/ml baie de organe 80, 74 Soluțiile stoc au fost adăugate la fiecare patruzeci și cinci de minute cu ajutorul unei micropipete Finn și s-a măsurat efectul. Concentrațiile adăugate sunt prezentate în Tabelul 3 de mai jos. Tabelul 3: Reprezentarea schemei de pipetare Cantitate adăugată Concentrație finală 3 µl 3 µmol/l 7 µl 10 µmol/l 20 µl 30 µmol/l 70 µl 100 µmol/l 11

21 Figura 4: Reprezentarea schematică a inimii (Netter FH 2003) 16

23 câștigaseră o piesă lungă de 3 cm. Izolarea trebuia făcută foarte atent, deoarece putea răni și întinde prea mult aorta. Aorta, ca toate celelalte preparate, a fost apoi plasată într-o cutie Petri cu Tyrode și fixată pe tamponul de plută cu două ace de disecare. Trebuia să te asiguri că nu este exagerat. Țesutul, grăsimea și sângele din jur au fost îndepărtate cu atenție și tăiate în bucăți de aproximativ 2 mm lungime. Piesele defecte și neregulate au fost eliminate. Figura 6: Reprezentarea schematică a aortei (Netter FH 2003) 18

24 3.5 Aparate utilizate Două aparate diferite au fost utilizate în experimente. În aparatul 1 s-au efectuat experimente pentru mușchii papilari și în aparatul 2 experimente aortice, atriale și intestinale. Organele erau agățate de traductoare de forță peste un fir de argint. Traductorul de forță a transformat forța mecanică într-un semnal electric și a trecut-o către un amplificator, care a amplificat semnalul electric și l-a desenat pe hârtie milimetrică cu ajutorul unui stilou. Pentru a putea compara experimentele, a trebuit să lucreze întotdeauna în aceleași condiții în ceea ce privește aprovizionarea cu oxigen, temperatura, valoarea pH-ului, producția și compoziția Tirodului. Aparatul 1 Aparatul 1 a fost utilizat doar pentru experimentele pe mușchii papilari. Construcție: Aparatul conține o baie de apă din sticlă acrilică. O cameră musculară iese în această baie de apă. Există, de asemenea, un trepied la care sunt atașate traductorul de forță, acționarea fină și suportul de organ. Consultați Figura 6 pentru o mai bună înțelegere

25 Figura 7: Schița aparatului 1 Camera musculară conține 25 ml, astfel încât același volum a fost utilizat pentru Tyrode. Baia de apă a fost controlată termostatic la o temperatură constantă de 35 ° C. Acest lucru a creat condiții fiziologice. Soluția nutritivă a trebuit să fie ajustată la această valoare, motiv pentru care Tyrode a fost plasat în cameră cu 10 minute înainte de experiment. Preparatul a fost descris anterior în capitolul. Pregătirea musculară a fost pusă în contact cu traductorul de forță cu cârligul de argint peste un fir de argint, mușchiul papilar a fost prins între electrod și un disc de plexiglas. Apoi, suportul a fost coborât în camera musculară, astfel încât specimenul să stea complet în Tyrode. Mușchii papilari nu bat spontan ca atriul, dar trebuie stimulați. Acest lucru a fost realizat cu un stimulator Accupulser (model Isostim 301T. WPI, Hamden, CT, SUA). Contracția a fost transmisă traductorului de forță prin sârma de clorură de argint, amplificată de amplificator și transmisă stiloului plat. 20

26 Figura 8: Ilustrația originală a aparatului Aparatul 2 Aparatul 2 (vezi Figura 8) a fost utilizat pentru testele pe aortă, artera pulmonară, ileonul terminal și atriul drept. Baia de apă a fost adusă la 37 ° C. În cazul aortei și arterei pulmonare, exemplarele în formă de inel au fost atașate direct la traductorul de forță folosind un fir de argint. În intestine și atrium, două cârlige de argint au fost atașate anterior la două capete și acestea au fost, de asemenea, conectate la traductorul de forță. În aparatul 2, obiectele testate au fost coborâte în băile de organe umplute cu Tyrode. Băile de organe au fost, de asemenea, setate la 37 ° C și gazate. O pre-tensiune a fost aplicată printr-o acționare fină, apoi a fost forțată o contracție și aceste contracții sau modificări ale acestora au fost convertite în semnale curente și înregistrate. 21

27 Figura 9: Schița aparatului 2 22

28 Figura 10: Imaginea originală a aparatului Convertor de forță Cu ajutorul convertorului de forță, modificările mecanice sunt transformate în electrice printr-un așa-numit pod Wheatstone, ceea ce face posibilă o măsurare. Există vergeturi în traductorul de forță. Când au existat modificări ale forței de contracție a organelor, rezistența la alungire și fluxul de curent au fost, de asemenea, modificate proporțional. Modificările în contracția și relaxarea mușchilor pot fi transferate către un aparat de înregistrat cu platformă (Flatbed Recorder model BD 112, de la compania World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, SUA) printr-un amplificator Kipp & Zonen). Acest lucru transferă impulsurile către hârtia milimetrică. 23

29 Figura 11: Schița alimentării traductorului de forță cu Carbogen În toate experimentele, a fost necesară o alimentare constantă a organelor cu gazul Carbogen pentru a obține un aport suficient de oxigen, un amestec uniform al ingredientului activ și pentru a menține valoarea ph constantă. Acest lucru a fost posibil cu ajutorul unui sistem de furtun care a fost conectat la fiecare baie de organe. Fritele de sticlă erau chiar în fața intrării în băi. Acestea au permis atomizarea fină și, împreună cu cleme la începutul furtunurilor, o dozare optimă a aerului. Figura 12: Imaginea originală a alimentării cu gaz 24

33 KCl luate și dizolvate în 100 ml Tyrode. Aici există și o contracție rapidă, care la fel de repede a scăzut din nou. Unul a așteptat aproximativ 45 de minute până la formarea unei faze de platou stabil. Substanța a fost adăugată din nou conform schemei cunoscute a arterei pulmonare (artera pulmonară). Cursul experimentului a fost același ca și în cazul aortei, singura diferență a fost tensiunea, care a fost întotdeauna constantă la 5 mV, adică 9,81 mn, a fost investigarea mecanismului de MAH 4HCL asupra intestinului Investigații cu glibenclamidă și nitro-L-arginină Intestinul a fost preparat așa cum este descris în capitol și fixat la aparatul 2. Pentru parcursul experimentului, a se vedea capitolul Aici s-a așteptat până la faza constantă de platou, apoi s-au adăugat antagoniștii gliebenclamidă sau nitro-L-arginină, concentrația finală în baia de organe fiind de 100 µmol/l. După 45 de minute, s-au adăugat 15 pl de soluție stoc și s-au lăsat să acționeze încă 45 de minute, după care s-a încheiat experimentul. Glibenclamid Figura 13: Glibenclamid (MW = 494,0 g/mol) 28

36 linia zero. În acest fel, puteți compara valorile proporțional. Pentru aceasta, a trebuit să se ia în considerare un factor de calibrare care a corespuns la 5 mv pentru 1 cm sau 0,98 mn. Dacă ați lucrat la 2 mv, valoarea trebuia să fie înmulțită cu 0,2 și la 10 mv cu 2 statistici. Pentru evaluarea statistică a forței de contracție și a frecvenței cursei, s-au calculat valorile medii și eroarea standard a valorilor medii (SEM). Programul Sigma Plot 9.0 a fost utilizat pentru a calcula aceste valori statistice și EC50. Acest program explică concentrația medie efectivă a ingredientului activ în mmol/l la care se atinge jumătate din valoarea de control. Pentru a observa probabilitatea de eroare, a fost efectuat testul t Student pentru observații pereche. Valorile mai mici de 0,1% (P 0,001) au fost foarte semnificative și valorile de 5% (P 0,05), 1% (P 0,01) au fost semnificative. Valorile cu probabilitate de eroare> 5% (P> 0,05) nu au fost valori semnificative. 31

38 Tabelul 5: Rezultatele testului MAH 4HCl pe atriul drept MAH4HCL f ± SEM f ± SEM (µmol/l) (x/min) (%) Număr de încercări de probabilitate de eroare (P) n Control 180 ± 8,66 0 ±, 50 ± 8,54 1,52 ± 2,60 4 ns, 50 ± 12,50-1,18 ± 5,08 4 ns ± 9,24-15,27 ± 3,87 4 0, ± ± 0 4 0,001 În Tabelul 5 prezintă valorile medii aritmetice (f) în bătăi/min și în procente, precum și erorile lor standard (SEM) pentru concentrația respectivă. n este numărul de încercări. 33

39 Diagrama 1: Curba efect-concentrație a MAH4 HCl în atriul drept AFRICAN n = 4 MAH 4 HCL EC 50 = 49 µmol/l 25 Scăderea frecvenței bătăilor (%) Conc. (Μmol/l) Această diagramă arată schimbarea frecvenței bătăilor cantitatea de substanță din camera organelor. Frecvența impactului a fost introdusă în% pe axa y și concentrația substanței testate pe axa x. Valoarea EC 50 a fost prezentată prin linii punctate și este de 49 μmol/l. Punctele arată valorile medii calculate ale frecvenței bătăilor la concentrațiile corespunzătoare, iar barele arată erorile lor standard. 34

40 Figura 15: Înregistrarea originală a efectului cronotrop al MAH4 HCl 12 sec 1 cm = 0,98 mn Efectul cronotrop negativ poate fi citit din numărul de bătăi. 35

41 4.1.2 Musculus papillaris Au fost efectuate patru teste pentru a evalua efectul inotrop asupra mușchiului papilar. Valoarea de control a fost de 1,58 ± 0,45 mn. Adăugarea substanței a dus la scăderea forței de contracție. La concentrația de 3 µmol/l această scădere a fost de -15,05 ± 8,34% și a devenit din ce în ce mai mare. La concentrația finală de 100 umol/l, forța de contracție a fost de 0,08 ± 0,02 mN sau 94,92 ± 1,58% din valoarea de control. Tabelul 6: Efectul MAH 4HCl asupra mușchiului papilar MAH4HCL fc ± SEM fc ± SEM (µmol/l) (mn) (%) Numărul probabilității încercărilor de eroare (P) n control 1,58 ± 0,45 0 ±, 23 ± 0 .43-15.05 ± 8.34 4 0 .99 ± 0.36-40.46 ± 5.70 4 0 .57 ± 0.19-65.92 ± 3.05 4 0.08 ± 0,02-94,92 ± 1,58 4 0,001 Acest tabel prezintă valorile medii aritmetice (fc) și abaterea lor standard (SEM) la concentrația prezentă atât în mn, cât și în procente. 36

42 Diagrama 2: Curba efect-concentrație a MAH4 HCl pe mușchiul papilar 0 MUSCULAR PAPILAR MAH 4 HCl n = 4 EC 50 = 15 µmol/l scăderea forței de contracție (%) conc. (Μmol/l) Această diagramă arată schimbarea forței de contracție în funcție de cantitatea de substanță din camera organelor. Scăderea forței de contracție în% a fost introdusă pe axa y și concentrația substanței testate în μmol/l pe axa x. Valoarea EC 50 a fost prezentată prin linii punctate și este de 15 μmol/l. Punctele arată valorile medii calculate ale forței de contracție la concentrațiile corespunzătoare, iar barele arată erorile lor standard. 37

43 Figura 16: Înregistrarea originală a efectului inotrop al MAH4 HCl 1 cm = 0,98 mn Scăderea forței de contracție poate fi văzută clar în lungimea amplitudinii. Lungimea amplitudinii scade odată cu creșterea concentrației substanței testate în camera de organe, care se bazează pe efectul inotrop negativ al substanței testate. 38