Transplantul de celule germinale primordiale pentru CRISPRCas9 bazat pe Leapfrogging în protocolul Xenopus

rezumat

Genele esențiale pentru supraviețuire reprezintă bariere tehnice în crearea unor descendenți mutanți. Leapfrog ocolește letalitatea prin combinarea editării genomului cu transplantul primordial de celule germinale pentru a crea animale sălbatice care poartă mutații ale liniei germinale. Arderea etapelor permite, de asemenea, generarea eficientă de mutanți homozigoti nulați în generația 1F. Aici, etapa de transplant este demonstrată.

Abstract

Introducere

Se așteaptă ca Bond să accelereze abordările genetice la Xenopus. Burn Steps oferă, de asemenea, o alternativă la metoda „transferului gazdei” 22 pentru analiza LOF a genelor cu efect matern (nepublicată). În această publicație, o descriere detaliată a metodei, axată pe transplantul de PGC, este prezentată în X. tropicalis (cu modificări minore pentru X. laevis). Transplantul PGC este demonstrat aici, pentru a facilita transferul mai rapid al acestei tehnologii către alte laboratoare care lucrează cu Xenopus. Principiile acestei metode trebuie să aibă succes la alți amfibieni (de exemplu, urodele), iar modificările specifice metodologiei organismului ar trebui să permită aplicarea la multe alte animale a căror mutageneză eficientă poate fi realizată și PGC este ușor transplantabil.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate metodele descrise aici au fost aprobate de Comitetul de planificare al Universității din California, Irvine și Institutional Animal Care.

1. Preparate destinate transplantului PGC

250 ug de ARNg sg; Vedeți-o Discuţie) 24. După 10 până la 20 de minute de vindecare a locului de injectare, transferați embrionii într-un vas acoperit cu agaroză care conține 1/9 x MMR și incubați la 25 ° C. De asemenea, creați un vas de embrioni non-gemeni care va servi ca beneficiari de transplant. Pregătiți vase Petri (60 mm) care conțin un

Strat de 5 mm grosime de 1% agaroză în 0,3 x MMR, dacă se fac transplanturi de organe în X. tropicalis, sau 1 x MMR pentru X. laevis.

Adâncime de 3-4 mm prin introducerea unei matrițe de 3 x 4 godeuri (creată prin tăierea unei plăci PCR cu 96 de godeuri) în agaroză topită în timp ce turnați plăcile (vezi Figura 1 și D). Țineți matrița la câțiva milimetri deasupra fundului vasului Petri cu o pereche de clești atașată la un suport pentru inel până când agaroza s-a întărit.

De asemenea, realizați o placă de embrioni unifamiliali cu 24 de godeuri acoperind godeurile cu un strat subțire de agaroză 1% în 1/9 x MMR.
Notă: Mediul de cultură adăugat la aceste godeuri este 1/9 x MMR suplimentat cu 50 µg de sulfat de gentamicină/ml.

2. transplantul PGC

3. după vindecare, îngrijirea embrionilor

NOTĂ: Grefele se vindecă la locul lor

30 de minute și este normal să observăm resturi de liză a celulelor gălbenușului care emană din embrion (Figura 3).

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

După transplant, trebuie făcută determinarea calitativă a eficacității mutagenezei CRISPR/Cas9 înainte de a depune orice efort în reproducere pentru a dezvolta și menține animalele până la maturitate sexuală. Deoarece animalele care transportă transplanturi de broască sunt de tip somatic sălbatic și linia germinală este dificil de accesat pentru măsurători directe, devine important să se salveze carcasele embrionilor donatori. Analiza ADN-ului carcasei acționează ca un proxy pentru măsurarea mutagenezei care apare la pacienții cu transplant de celule germinale 17 .

Rezultate similare au fost obținute de la 17 animale care se încrucișează cu F0 care poartă mutații în cutia homeotică (care codifică homeodomeniul care leagă ADN-ul) al genei goosecoide (CGC) (vezi Figura 4a, C-H). Lipsa expresiei CGC utilizând oligonucleotide morfolino antisens în X. laevis sugerează că gena CGC este necesară pentru dezvoltarea completă a capului anterior 32, iar mormolile injectate Cas9-sgRNA văd și fenotipuri letale embrionare 17. Cu toate acestea, animalele sălbatice 0 F, fiind de tip somatic sălbatic, sunt viabile și robuste, iar embrionii produși 1 F intercross cu fenotipuri LOF identici cu cei publicați în X. laevis fold trec 17. Aceste date furnizează coroborarea genetică a fenotipului morfolinic, precum și dovada principiului că etapele de săritură depășesc fenotipurile letale embrionare.

Figura 1: Materiale necesare transplantului. Sticlă borosilicată (LA) Pipetele Pasteur sunt utilizate pentru fabricarea cuțitelor și a buclelor de păr pentru sprâncene pentru microchirurgie pe embrioni în stadiu incipient. Desenarea pe sticlă folosind un arzător Bunsen permite un capăt mai îngust pentru inserarea părului. Săgeata roșie indică poziția aproximativă la care ar trebui să se spargă geamul. () un exemplu de cuțit pentru păr pentru sprâncene (sus) și buclă pentru păr (jos), pipetat cu clei cu uscare rapidă. (VS), o porțiune dintr-o placă de PCR cu 96 de godeuri este utilizată pentru a crea depresiuni într-o placă de gel de agaroză, permițând agarozei de 1% să se solidifice în jurul matriței (agaroză făcută la 0,3 x 1 x MMR, conform căreia transplanturile de organe sunt efectuate în X. tropicalis sau respectiv X. laevis). Grosimea agarozei este

5 mm, cu puțuri adânci de 3-4 mm. (D) un exemplu de placă de gel de agaroză transplantată, cu 12 depresiuni, așa cum se arată în tabel VS. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.