Acidul linoleic conjugat Cis-9, trans-11 inhibă procesele inflamatorii în modelele de astm in vitro și în

1 DE LA INSTITUTUL PENTRU ȘTIINȚELE NUTRITIVE ALE FRIEDRICH-SCHILLER-UNIVERSITĂT JENA LEHRSTUHL FIZIOLOGIE NUTRITIONALĂ Cis-9, acidul linoleic conjugat trans-11 inhibă procesele inflamatorii în modelele de astm in vitro și in vivo Disertație prezentată consiliului doctorului în gradul academic Facultatea de Farmacie a Universității Friedrich Schiller Jena de Anke Magdalena Jaudszus din Mechterstädt Jena, 2008

2 recenzori: 1. Prof. Dr. Gerhard Jahreis 2. Prof. Dr. Stefan Lorkowski 3. Prof. Dr. Dr. Lămpile Alfonso Data disputării: 26 februarie 2009

3 Părinții mei Annemarie și Dietmar și toți copiii din studiul CLA

4 CUPRINS Lista prescurtărilor V Lista figurilor VII Lista tabelelor IX 1 Introducere Astm bronșic Definiție și epidemiologie Diagnostic Fiziopatologie Bazele imunologice Sensibilizare alergică Reacții alergice Cauze și factori de risc Genetică Factori de mediu Infecții și igienă Ipoteză Dieta Hipoteză Sinteza CLA Efecte fiziologice chimice bacteriene Receptorii activați cu proliferator de peroxizomi (PPAR) Membrii familiei PPAR Structura Controlul expresiei genelor PPAR și inflamația căilor respiratorii CLA dezvoltă efecte antiinflamatorii prin PPAR Obiectiv ipoteză Obiectiv special Partea I: Imunologie Model in vitro Model in vivo Partea II: Metabolism Material și metode Model in vitro Metode biologice celulare Stimulanți și inhibitori Acizi grași Antagonist PPARγ GW lipopolizaharidă Z elllinie cultivare BEAS-2B stimularea stocării pe termen lung a izolării și purificării BEAS-2B a eozinofilelor citometrie în flux co-cultură a BEAS-2B și a eozinofilelor I.

7 CUPRINS 9.4 Incorporarea c9, t11-cla în BEAS-2B după detectarea 24 h a t7, c9- și t8, c10-cla în c9, t11-cla-peak Ulei suplimentat: c9, t11-cla-triazilglicerol Ulei suplimentat: CLA-Mix Triazilglicerol Distribuția acizilor grași după o dietă bogată în ulei de măsline Declarație Mulțumiri Publicații și contribuții la congres CV IV

28 INTRODUCERE (Chin și colab. 1994). Cu toate acestea, deoarece majoritatea studiilor au fost realizate cu amestecuri de izomeri care conțineau c9, t11-cla și t10, c12-cla în părți aproximativ egale și cantități mici de alți izomeri, efectele observate nu au putut fi atribuite în mod clar unuia sau altuia izomer. Metodele de sinteză îmbunătățite pentru reprezentarea izomerilor individuali permit acum o perspectivă mult mai diferențiată asupra modurilor de acțiune destul de diferite și uneori contradictorii ale c9, t11-cla și t10, c12-cla (Tab. 2 și 3). 16

48 MATERIAL ȘI METODE Detecție: Reactiv enzimatic: Anticorp secundar: IL-8 mAb anti-uman biotinilat (clona G 265-8, BD Pharmingen): 1 µg/ml în tampon de blocare Avidin-HRP (BD Pharmingen) 1: 1000 în tampon de blocare Reactiv substrat: TMB 1: 100 în tampon Gallati TMB: 240 mg 3,3,5,5 -TMB (Fluka, Neu-Ulm, D) 5 ml DMSO (Sigma) 5 ml etanol tampon Gallati: tampon citrat: Stop Soluție: 0,034% H2O2 (Merck) în tampon citrat 33,6 g acid citric monohidrat în 400 ml apă distilată. se dizolvă cu KOH 4 N, se ajustează la ph 3,95, cu apă distilată. se completează până la 500 ml 1 M H 3 PO 4 (toate Merck) ELISA pentru cuantificarea ECP ELISA pentru detectarea ECP a fost realizată utilizând un kit disponibil comercial (MBL, MoBiTec, Göttingen, D) conform recomandărilor producătorului. Cele 96 de plăci de microgode conținute în kit erau deja acoperite și soluțiile erau gata de utilizare sau erau pregătite conform instrucțiunilor. Limita de detecție a acestui kit a fost de 0,125 ng/ml. 36

49 MATERIAL ȘI METODE Model in vivo BALB/c de sex feminin au fost obținute de la Harlan Winkelmann (Borchen, D) și aveau 6-8 săptămâni când au fost admise. Toate experimentele au fost aprobate de Oficiul de Stat pentru Siguranță în Muncă, Protecția Sănătății și Siguranța Tehnică din Berlin (LAGetSi) ca o extensie a unei aplicații existente de experimentare pe animale (Reg G 0247/03) conform Legii germane privind protecția animalelor. 3.4 Uleiuri CLA suplimentate cu furaje C9, triazilglicerol bogat în t11-CLA (Tab. 6, Fig. 13) a fost realizat folosind metoda de conversie a metil ricinolatului () și preparatului CLA-Mix (Tab. 6, Fig. 13) Izomerizarea catalizată de bază a acidului linoleic pe baza uleiului de șofrănel produs (atât Cognis, Illertissen, D). Tabelul 6: Compoziția cu acizi grași a preparatelor CLA. Analiza GC. Acid gras [% TBE] c9, t11-clear TAG CLA mix TAG C14: 0 0 0 C16: 0 0,2 2,6 C18: 0 0,5 2,8 C18: 1c9 1,8 14,4 C18: 1c11 0,3 0,7 C18: 2n6 3,1 0,3 C18: 3n3 0,2 0 C20: 0 0,1 0 C20: 1 0,5 0 C20: 5n3 0,4 0 CLA 86,6 78,0 Altele 6.7 1.4 Abrevieri: ester metilic al acidului gras TBE, triazilglicerol TAG 37

50 MATERIAL ȘI METODE A c9, bogat în t11-cla ZI B amestec CLA ZI 1,4% 0,3% 0,4% 22,1% c9, t11-cla 0,1% 0,4% c11, t13 -cla t10, c12-cla c9, c11-cla t9, t11-cla 45,0% 52,6% 74,9% Fig. 13: Distribuția izomerilor preparatelor CLA. A: c9, T11-TAG bogat în cla. B: CLA-Mix DAY. Se afișează procentajul din totalul CLA. Analiză HPLC (9.5) Regim de hrănire După 5 zile de adaptare la condițiile de adăpostire (22 ° C, ciclu de lumină/întuneric de 12 ore, maxim 5 animale/cușcă în sistemul de raft IVC), animalele au fost repartizate aleatoriu în grupurile de testare. Dietele de probă s-au bazat pe dieta de întreținere V1535 de la ssniff (Soest, D) și au fost comenzi speciale care au fost îmbogățite cu uleiurile respective (Tab. 7). Tabelul 7: Compoziția cu acizi grași a dietelor testate [g/kg]. Control de bază al alimentării Controlul prevenției primare Prevenirea secundară c9, t11- CLA CLA-Mix acid gras Ulei adăugat 1,5% ulei de floarea soarelui d, 3% ulei de măsline d, 5% ulei de floarea-soarelui 1,5% c9, t11-clar TAG C14: 0 0,1, 1 0,1 0,1 0,1 0,1 C16: 0 4,7 5,6 5,0 5,6 4,7 5,1 C18: 0 0,8 1,4 1,2 1,4 0,9 1,2 C18: 1c9 6,2 10,0 16,1 10,0 6,5 7,7 C18: 2n6 18,0 27,8 18,8 27,8 18,4 18,3 c9, t11-cla, 9 5.0 c9, c11-cla, 9 0.1 t10, c12-cla, 9 C18: 3n3 2.3 2.5 2.4 2.5 2.5 2.3 C20: 0 0, 1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 C20: 1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 C20: 4n Altele 0,3 0,3 0, 3 0,3 0,7 0,3 1,3% CLA-Mix ZIUA 38

56 MATERIAL ȘI METODE Tabelul 9: Grunduri și sonde utilizate pentru amplificarea PPARγ. Primer de secvență de nucleotide genice FW 5 -TAA CTG CCG GAT CCA CAA A-3 PPARγ primer RV 5 -ATC TCC GCC AAC AGC TTC T-3 sondă 5 fam-ctg TCG GTT TCA GAA GTG CCT TGC-3 tam primer FW 5 -GTT TGA GAC CTT CAA CAC CCC A-3 ß-actină primer RV 5 -GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA-3 sondă 5 vic-cca TGT ACG TAG CCA TCC AGG CTG TG-3 tam Șablon de 10 µl (100 ng) au fost 40 µl amestecului de reacție optimizat este pipetat (Tab. 8) și analizat în triplicate pe plăci optice cu 96 de godeuri (ABgene, Epsom, UK) în sistemul PCR în timp real (Applied Biosystems) utilizând următorul program de temperatură: Tabelul 10: Programul de temperatură pentru amplificare de PPARγ. Temperatură [C] Cicluri de timp min min s 60 1 min 40 O serie de diluție a ARN-ului total extras din celulele LA-4 a fost inclusă ca standard intern în fiecare etapă. Metode biochimice de proteine ELISA pentru determinarea IL-5 în BAL. Realizarea ELISA: Compoziția soluțiilor: Acoperire: Anticorp primar: IL-5 mAb anti-șoarece (clonă TRFK5, BD Pharmingen): 2 µg/ml în tampon de acoperire Tampon de acoperire: 8,4 g NaHCO 3, în 1 l apă distilată . se dizolvă, se ajustează la pH 8,2 cu 10 N NaOH tampon de spălare: 0,05% Tween 20 în PBS 44

62 MATERIAL ȘI METODE ANOVA). Deoarece doar efectele principale ale dietelor ar putea fi interpretate pentru acest parametru, diferențele dintre grupuri au fost determinate folosind teste T ale elevilor nepereche. Curbele P enh au fost evaluate folosind ANOVA pentru măsurători repetate. Compararea grupurilor O9 c9, t11-cla cu și fără GW9662, precum și datele din abordarea de prevenire secundară și concentrațiile tisulare ale acizilor grași a fost realizată utilizând analiza univariantă a varianței (ANOVA). Influențele dietelor asupra compoziției acizilor grași a organelor examinate au fost evaluate prin intermediul unei analize de corelație. Pragul de semnificație a fost stabilit la o probabilitate de eroare de 5% (p 0,05). 50