Analiza HPLC a optimizării metodei vitaminei C și crearea valorii de referință - PDF gratuit

De la Laboratorul Central Campus Lübeck al Centrului Medical al Universității Schleswig-Holstein Șef: Prof. Dr. med . Seyfarth și facultatea de medicină a Universității din Lübeck Decan: Prof. Dr. med . Solbach Analiza HPLC a vitaminei C: optimizarea metodei și crearea valorii de referință Disertație inaugurală pentru obținerea unui doctorat de la Universitatea din Lübeck - de la facultatea de medicină - prezentată de Cornelia arlene Focke din Bremen Lübeck 2010 1

crearea

1. Raportor: Prof. Dr. med. ichael Seyfarth Al doilea raportor: Priv.-Doz. Dr. med. Gunther Eitz Ziua examenului oral: 09/06/2010 Aprobat pentru tipărire. Lübeck, 6 septembrie 2010 a semnat prof. Dr. med. erner Solbach - Decanul Facultății de Medicină 2

mâncați ceea ce este măsurabil. (Galileo Galilei) 3

2.2.8 Studii privind stabilitatea probelor. 31 2.2.9 Metode HPLC optimizate pentru determinarea acidului ascorbic în ser și plasmă. 32 2.2.10 Investigații privind vitamina C. din urină și lichior. 32 2.3 Validarea metodei. 33 2.3.1 Examinări pentru corectitudine. 33 2.3.2 Studii de precizie. 33 2.3.3 Investigații privind limita de detectare și cuantificare. 34 2.3.4 Investigații privind liniaritatea măsurătorii. 34 2.4 Aplicarea metodelor: determinarea valorilor de referință și investigații în cinetica vitaminei C. 34 2.4.1 Valorile de referință. 34 2.4.2 Cinetică. 35 2.5 Metode statistice. 35 3. Rezultate. 37 3.1 Optimizarea și validarea metodei. 37 3.1.1 Faza staționară. 37 3.1.2 Faza obilă. 37 3.1.3 Standard intern. 40 3.1.4 Corectitudinea. 40 3.1.5 Precizie. 41 3.1.6 Limita de detectare. 41 3.1.7 Zona de luat masa liniară. 42 3.1.8 Stabilitatea probelor de vitamina C. 42 3.1.9 Măsurarea probelor de urină și LCR. 46 3.2 Aplicarea metodelor. 47 3.2.1 Determinarea valorii de referință. 47 3.2.1.1 Examinarea diferențelor specifice vârstei. 49 3.2.1.2 Examinarea diferențelor specifice sexului. 51 3.2.2 Cinetica vitaminei C. 53 4. Discuție. 56 4.1 optimizarea metodei. 56 4.2 Limitele metodei. 58 4.3 Valori de referință. 58 4.4 Cinetică. 59 4.5 Utilizări posibile. 60 4.6 Outlook. 60 5

5. Rezumat. 61 6. Anexă. 62 Bibliografie. 67 Mulțumiri. 80 curriculum vitae. 81 Declarația de independență și declarația de cerere. 82 6

Lista abrevierilor Fig. Figura Apă distilată Aqua d zi ECD detecție electrochimică EDTA Acid etilendiaminetetraacetic HPLC cromatografie lichidă de înaltă performanță I.E. unități internaționale i.v. intravenos kg kg kg greutate corporală l litru LDL lipoproteină cu densitate scăzută mg iligramă min inut ml ililitru µmol ikromol mmol ilimol PA acid meta-fosforic na nanampère nr. Număr pavk boală arterială periferică ocluzivă PCA acid percloric rp HPLC fază inversă HPLC RT temperatura camerei s. vezi fila deviație standard SD. Tabelul U rotații UV ultraviolet V volți VK coeficient de variație 7

În plus, printr-o interfață care permite controlul sistemului și înregistrarea și evaluarea datelor de măsurare cu ajutorul unui computer. Fig. 5: Reprezentarea unui sistem HPLC cu fază mobilă (solvent), pompă, sistem de injecție (injector), coloană (coloană HPLC), detector (detector), deșeuri (aste) și computer conectat pentru evaluarea datelor (date) http://www.chemistry.nmsu.edu/instrumentation/aters_hplcsystem.gif). Deoarece compușii sunt reținuți pe faza solidă pentru diferite perioade de timp (timp de retenție), substanțele pot fi identificate, adică analiza calitativă. În cromatogramă, reprezentarea grafică a semnalului detectorului (axa y) în raport cu timpul (axa x), înălțimea deviației, așa-numitul vârf, permite, de asemenea, o determinare a concentrației, adică o analiză cantitativă, prin calculul înălțimii sau al ariei. Fig.6: Exemplu de cromatogramă. Cantitatea de deviere (axa y) este reprezentată grafic în funcție de timp (axa x) (timpul de reținere). A și B prezintă două vârfuri de înălțimi diferite. 20

Investigarea sistematică a stabilității probelor în diferite medii Crearea valorilor de referință pentru diferite grupe de vârstă Investigarea cineticii vitaminei C la voluntarii sănătoși În plus, trebuie verificat dacă metoda optimizată este, de asemenea, adecvată pentru determinarea vitaminei C în alte fluide biologice, în special în urină. și lichidul cefalorahidian. 26

2. Material și metode 2.1 Echipamente, materiale de testat, substanțe chimice 2.1.1 Echipament Sistem HPLC: pompă inteligentă L-6220 (erck Hitachi) Interfață D-6000A (erck Hitachi) Autosampler AS-2000A (erck Hitachi) Degasser (Knauer) L- 4250 Detector UV-VIS (erck Hitachi) Detector amperometric L-3500A (rețetă erck) Coloană HPLC și coloană de protecție: Synergi 4 µm Hydro-RP 80A 150 x 4,6 mm (Phenomenex 00F-4375-E0) -C18 Cartuș 4 x 3,0 mm (Phenomenex AJ0-7511) Software HPLC: odel D-7000 Chromatography Data Station Software HPLC system anager (erck) Sistem de filtrare: Dispozitiv de filtrare sub vid (ilipor) Filtru acetat de celuloză 0,2 µm dimensiunea porilor ( Sartorius AG 11107-47-N) Alte dispozitive: ph-eter (ettler Delta 345) Vortex ischer aage (ettler Toledo Ag 241) baie cu ultrasunete 2.1.2 Seruri, plasme, lichior și urină Seruri și plasme: Pentru dezvoltarea și validarea metodelor au fost Sere și plasme reziduale, urine și lichioruri din analiza de rutină a laboratorului central al U. spital universitar 27