Analiza profilului metabolic al protocolului embrionilor de pește zebră (tradus în franceză)

rezumat

Peștele zebră constituie un model puternic de vertebrate care a fost subutilizat pentru studii metabolice. Aici descriem o modalitate rapidă de a măsura profilul metabolic in vivo al dezvoltării peștilor zebră, care permite compararea diferiților parametri ai funcției mitocondriale între embrioni manipulați genetic sau farmacologic, crescând astfel aplicabilitatea acestui organism.

Abstract

Protocol

Partea 1: Tratarea chimică a embrionilor de pește zebră

1. Colectați embrioni de pește zebră după fertilizare. Incubați la 28,5 ° C în mediu E3 în cutii Petri de 100 × 15 mm. Notă: Pentru hibridizare in situ sau colorare cu ulei roșu-O, se adaugă 1-fenil-2-tiourea (PTU) la o concentrație finală de 0,2 mM pentru a inhiba formarea pigmentului 1, dar nu este necesar pentru analiza hipocampului.
2. Pentru studii farmacologice, adăugați substanța chimică necesară la o concentrație finală adecvată pentru dezvoltarea embrionilor de pește zebră la aproximativ 26 de ore după fertilizare (HPF) cu o comandă adecvată numai pentru vehicul. Notă: sensibili la inhibitori farmacologici ușori, embrionilor li se poate permite să se dezvolte în fața întunecată a analizei.

Partea 2: Profil metabolic direct cu ajutorul analizorului Hippocampus XF 24

La sfârșitul testelor, se calculează valorile medii ale ordinului 10 și 10 embrioni tratați chimic.

Partea 3: colorare cu ulei roșu O

1. Embrionii la 50 CPF sunt decorionați folosind o pință fină și fixați în 4% PFA peste noapte la 4 ° C.
2. Se efectuează colorarea cu ulei roșu, așa cum s-a descris anterior 2 (vezi Figura 4).

Rezultate reprezentative

Suntem interesați să înțelegem rolul genelor specifice asupra metabolismului, în special rata respirației și metabolismul lipidelor. Prin urmare, am tratat embrionii sălbatici de pește zebră de tipul HPF luna 26 cu un inhibitor farmacologic specific al enzimei codificate de una dintre aceste gene. La 50 CPF, jumătate din embrionii tratați cu vehicul și inhibitori au fost analizați folosind Seahorse pentru funcția mitocondrială, în timp ce cealaltă jumătate a fost setată la 4% PFA peste noapte la 4 ° C și apoi colorată pentru depunerea lipidelor cu ulei-roșu-O. Tratamentul cu inhibitorul enzimei specifice a dus la

De 2 ori mai multă respirație bazală (figura 4A), care a fost asociată cu depunerea crescută a lipidelor în special în telencefal și sub vezicula otică (Figura 4B, C).

pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>Figura 1. Reprezentarea schematică a tratamentului chimic al embrionilor de pește zebră. Embrionii de tip sălbatic, prelucrați genetic sau prelucrați farmacologic sunt fond.

Figura 2. Placa insulei XF24 în poziție. (A) Patru godeuri conțin mediu embrionar numai ca control al temperaturii (marcat cu un X), iar celelalte conțin un embrion/godeu. (B) Prim-plan al unei fântâni (C6) care prezintă un embrion de tip sălbatic de 50 CPF tratat cu vehicul (DMSO) acoperit de o captură de ecran cu insulă (vârf de săgeată).

Figura 3. RespiratParametri ionici de tip sălbatic pentru 50 de embrioni de pește zebră HPF. (A) Pentru fiecare măsurare, este prezentată media celor 20 de embrioni individuali. Respirație bazală (medie: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), respirație maximă (medie: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), capacitate de respirație de salvare (medie: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) Pentru fiecare măsurare, este afișată media celor 20 de rezultate individuale. Respirația mitocondrială bazală; respirația mitocondrială datorată fluctuației ATP; respirația mitocondrială decuplată și respirația non-mitocondrială. Mt: mitocondrial; SRC: Piesă de schimb Capacitate respiratorie; SD: deviație standard, SEM: eroare standard a mediei. Rezultatele sunt prezentate în pmoli de O2 consumat/min/embrion. Faceți clic aici pentru a mări figura .

---