Aplicarea markerilor de microparticule pentru a studia fiziologia digestivă a Brachionus
Aplicarea markerilor de microparticule pentru investigarea fiziologiei digestive a Brachionus plicatilis (Rotatoria) DISERTATURA INAUGURALĂ pentru obținerea diplomei de doctorat a Facultății de Matematică și Științe Naturale de la Universitatea din Köln prezentată de Nicole Anita Lindemann de la Duisburg Köln 2001
Raportor: prof. Dr. W. Kleinow Prof. Dr. M. Dambach Prof. Dr. H. Arndt Ziua examenului oral: 11 mai 2001
Cuprins 3.2.4 Influența factorilor de mediu asupra trecerii alimentelor 96 3.2.4.1 Examinarea microscopică a valorii ph în stomac și intestin a B. plicatilis 96 3.2.4.2 Influența valorii ph în mediu 102 3.2.4.3 Compararea ratelor de absorbție și filtrare în medii tamponate 105 3.2.5 Investigarea proceselor de absorbție în tractul digestiv al B. plicatilis 116 3.2.5.1 Absorbția hemoglobinei 116 3.2.5.2 Detectarea directă a absorbției proteinelor 121 3.3 Observații finale și discuții generale 125 4. Rezumat 130 5. Bibliografie 132 Mulțumiri Explicație relua
Rezumat Conținutul tractului digestiv al B. plicatilis poate fi schimbat rapid și ușor prin introducerea unui nou tip de particule în mediu. Celulele de drojdie au fost utilizate pentru a înlocui eritrocitele din tractul digestiv și pentru a examina capacitatea rotiferelor de a controla ingerarea particulelor de nutrienți. Utilizarea celulelor de drojdie colorate în albastru de bromotimol face posibilă determinarea diferențelor în valorile ph ale stomacului și intestinului. Mai mult, în experimentele de hrănire aceste celule sunt utile pentru a examina diferențele de secreție a ionilor H + de către intestin în mediul de cultură de diferită molaritate. În cele din urmă, procesele de absorbție ar putea fi demonstrate prin înlocuirea fantomelor eritrocitelor marcate cu fluorescență cu fantome neetichetate și prin detectarea fluorescenței reziduale de lungă durată în celulele stomacului. 2
Material și metode 2. Material și metode 2.1 Abrevieri frecvent utilizate DTT FITC HEPES LSM MES RSA SDS TRA Tris rpm 1,4-Dithio-DL-Threit (ol) Fluorescein Isothiocyanate N-2-Hydroxyethylpierazine-N -2-etansulfonic Scanare laser -Microscop N-morfolină etansulfonic acid bovin ser albumină sodică dodecil sulfat trietanolamină clorhidrat tri (hidroximetil) aminometan revoluții pe minut
Material și metode 2.2 Producător de substanțe chimice, substanță Grad de puritate Appli Chem (Darmstadt) Albumină din ser bovin Citrat (acid citric monohidrat) p. A. DTT MES de calitate tampon hidroxid de sodiu p. A. Acid clorhidric p. A. TRA p. A. Boehringer (Mannheim) Tris cristalin Merck (Darmstadt) albastru bromotimol albastru bromofenol albastru glutaraldehidă soluție 25% clorură de potasiu p. A. Fosfat de hidrogen de potasiu p. A. Hidroxid de potasiu sulfat de magneziu pur 7-hidrat p. A. Carbonat de sodiu p. A. Clorură de sodiu p. A. Dihidrogen fosfat de sodiu 1 hidrat p. A. Hidrocarbonat de sodiu p. A. hidrogen fosfat disodic dihidrat p. A. Amestec de sare de ditionit de sodiu Sera (Heinsberg) 6
Material și metode Producător, substanță Nivel de puritate Serva (Heidelberg) Cloramfenicol Heparină SDS Zaharoză (zaharoză) grad de cercetare grad de cercetare cristalin Sigma (München) FITC HEPES Lyticază (de la Arthrobacter luteus) Merthiolat (Timerosal) Riedel-de-Haën (Hanovra) Amoniu carbonat de aici Amoniu Produsele chimice care nu sunt enumerate provin (în calitate PA) de la Merck, Darmstadt. Dacă nu se specifică altfel, soluțiile utilizate au fost amestecate cu Aqua bidest. programat. Al 7-lea
Material și metode 2.3 Materiale speciale MARCA (Wertheim/Main) Capilare micro hematocrite heparinate (lungime: 75 ± 1,00 mm; diametru interior: 1,15 ± 0,05 mm; diametru exterior: 1,55 ± 0,05 mm), Cameră de numărare, Neubauer (adâncimea camerei: 0,1 mm; rețea de numărare: 9 pătrate mari fiecare 1 mm 2) Lance de sânge sterile BRAUN (Melsungen), Solofix CORNING COSTAR GmbH (Bodenheim) Membrană din poliester Tanswell-Clear (diametru 24 mm, dimensiunea porilor 0,4 µm) PLANO (Wetzlar) Prep-Eze: coș (tip A) cu o dimensiune a ochiului de 75 µm tub de dializă ROTH (Karlsruhe) din celuloză, Spectra/Por Membrane 3, MWCO: 3.500 atelier de aparate de filtrare al Institutului Zoologic (Universitatea din Köln) (Lindemann & Kleinow, 2000), vezi Figura 1, constând dintr-o țeavă din PE cu o ștampilă bine fixată și două prize de închidere. Ștampila este acoperită cu un tifon Polymon (PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Zurich, dimensiunea ochiurilor de plasă 16 µm). Aparat de filtrare mic, fabricat dintr-o seringă de sticlă FORTUNA OPTIMA de 5 ml (Walter Graf and Co. GmbH & Co., Wertheim) cu un tifon acoperit (Polymon Gaze PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Zurich, dimensiunea ochiurilor de plasă 16 µm) ștampilă PE; Ieșirea seringii poate fi închisă cu un storcător. A 8-a
Material și metode 10 cm B A C Fig. 1: Aparat de filtrare pentru concentrarea rotiferelor sau pentru îndepărtarea particulelor mici (eritrocite, alge sau celule de drojdie) din mediul care conține rotifer. O ștampilă sigilată bine acoperită cu un tifon din polimon (dimensiunea ochiului de plasă 16 µm) B scurgere pentru mediu de spălare C scurgere pentru rotifere concentrate fără particule 9
Material și metode 2.4 Metode de observare microscopică 2.4.1 Microscop cu lumină Au fost utilizate următoarele: a) Un microscop cu lumină transmis Laborlux K (Leitz, Wetzlar, mărire între 40 și 1000). b) Un microscop inversor cu lumină transmisă Wilovert (Will, Wetzlar, mărire între 40 și 320). 2.4.2 Microscop de fluorescență Examinările de fluorescență au fost efectuate pe un microscop de fluorescență Orthoplan (Leitz, Wetzlar, măriri 63-400) cu filtrul de excitație L2 450-490 (splitter 510, filtru de blocare 525/20). Animalele au fost observate pe diapozitive de microscop sub ochelari de acoperire. 2.4.3 Imagini microscopice Imaginile microscopului luminos au fost realizate cu o cameră reflexă Minolta X-300 cu atașament obiectiv Leitz Periplan (GF 12,5; TL 160 mm 10). Au fost utilizate următoarele filme: Ilford PAN F Plus 50 ASA (film negativ alb-negru), Kodak EKTAR 100 ISO 100/21 (film negativ color), Kodak EKTAR 1000-2 (film negativ color), Kodak Royal Gold 100 ISO 100/21 (film negativ color) ), Scotch CHROME 640-T ISO 640/29, 3200 k (film color pentru diapozitive pentru lumina lămpii incandescente). Un filtru albastru a fost folosit pentru a compensa ușoara nuanță galbenă cauzată de lumina artificială. 10
Material și metode 1 2 Fig. 2: Aranjament pentru observarea animalelor individuale pe o perioadă mai lungă de timp. Animalele ținute pe loc cu ajutorul unui capilar din sticlă Pyrex () sunt observate în mediul de hrănire printr-un microscop inversat. Capilarul de sticlă este ținut și ghidat de un micromanipulator. Presiunea negativă din capilarul de reținere este verificată cu ajutorul unei seringi de 2 ml (). 1 = micromanipulator, 2 = diapozitiv cu atașament de 1 ml. 16
Materiale și metode 2.5.4 Imobilizarea rotiferelor cu ditionit de sodiu Pentru a examina microscopic un număr mare de rotifere, animalele au fost imobilizate cu ditionit de sodiu. 500 pl de rotori care conțin mediu au fost injectați într-un vas de reacție Eppendorf cu 500 pl de ditionit de sodiu (40 mg/ml). După tratament, rotiferele se scufundă pe fundul vasului într-o stare complet extinsă. Pentru a determina numărul total de animale și numărul de animale cu un tract digestiv umplut (de culoare roșie), în funcție de concentrația rotiferelor, 20-100 μl au fost pipetate din vas pe o lamă de sticlă măcinată. 2.5.5 Producția tamponului de dizolvare Producția lui von Kleinow și colab. (1991) tampon de dizolvare dezvoltat s-a întâmplat după cum urmează: În 2 ml aqua dest. S-au dizolvat 0,18 M SDS și 0,03 M hidrogen carbonat de amoniu (pH 8). Înainte de începerea experimentului, s-au adăugat 0,04 g de DTT la soluție. 17
Material și metode 2.6.4 Fantome eritrocitare 2.6.4.1 Prepararea albuminei FITC (Wißling, 1988 și Johnson & Halborow, 1986) Pentru a preveni difuzia colorantului fluorescent din fantome, acesta a fost legat de proteine: 0,5 M mai alcalin Tamponul (pH 9,5) a fost furnizat prin adăugarea a 5,8 ml dintr-o soluție de Na2C03 5,3% la 10 ml dintr-o soluție de NaHCO3 4,2%. 50 mg de albumină au fost preluate în 4,5 ml de soluție de NaCI 0,9% și s-au adăugat 0,5 ml de tampon alcalin; după amestecarea amănunțită, s-au adăugat 1,5 mg de FITC și soluția a fost agitată la 22-25 ° C timp de 2 ore. Acest amestec s-a dializat peste noapte împotriva a 4 l de soluție salină fiziologică într-un basculant pentru dializă. Complexul fluorescență-proteină terminat a fost depozitat într-un loc răcoros și întunecat. 2.6.4.2 Soluții Soluție de spălare: tampon hiposmotic: Tampon de spălare: 0,9% soluție NaCl 5 mm soluție MgSO 4 160 mm KCl/5 mm soluție HEPES, pH 7,4 Toate soluțiile au fost utilizate pentru prepararea fantomelor la aprox. C răcit. 2.6.4.3 Producția de fantome descărcate și încărcate Sânge proaspăt de mamifer heparinizat (ovine sau bovine) a fost centrifugat la 5000 rpm la 4 ° C timp de 10 min. După decantarea supernatantului plasmatic și a stratului superior conținând leucocite ale coloanei celulare, Sedi-20
Material și metode 2.6.4.4 Fantomele fixate cu glutaraldehidă Fantomele încărcate au fost pregătite și fixate conform descrierii din secțiunile 2.6.3 și 2.6.4, soluția de glutaraldehidă fiind adăugată fantomelor preparate și răcite fără spălare prealabilă . 22
Material și metode Coșuri de filtrare pentru eșantionare Rotifere Eritrocite Fig. 3: Ilustrație schematică a eșantionării: Pentru măsurătorile fotometrice, eșantionul este pipetat dintr-un coș de filtrare care este accesibil eritrocitelor, dar nu și rotiferelor. Acest lucru a fost realizat prin lipirea a 2-3 coșuri de țesut (dimensiunea ochiurilor de plasă 75 µm, Plano GmbH Wetzlar). În prima oră, a fost prelevată o probă la fiecare 5-10 min, în cursul următor al testului doar la fiecare 20-30 min. Când s-au prelevat probele, s-au pipetat 2 ml din coșul filtrant într-o cuvă. Pentru a se asigura că suspensia din insertul filtrului corespunde aproximativ concentrației eritrocitelor sau hemoglobinei eliberate în mediul înconjurător, conținutul coșului filtrant a fost transferat de mai multe ori cu ajutorul unei pipete în mediul extern înainte de prelevarea fiecărei probe. 24
Material și metode 2.7 Pregătirea celulelor de drojdie 2.7.1 Producerea suspensiei de drojdie 0,5 g de drojdie de panificație (Saccharomyces cerevisiae) au fost agitate în 100 ml apă de mare până când drojdia a fost distribuită uniform. 2.7.2 Prepararea tamponului fosfat conform Sørensen 0,2 M tampon fosfat pH 7,0 a fost preparat prin combinarea a 30,5 ml dintr-o soluție 0,2 M Na 2 HPO 4 și 19,5 ml NaH 2 PO 4 0,2 M - Soluție făcută. Am obținut un tampon Sørensen de 0,067 M prin diluarea a 6,7 părți din tampon cu 13 părți de apă distilată. (Dawson și colab., 1969). 2.7.3 Prepararea tamponului de fosfat de potasiu KH 2 PO 4 (0,05 M) a fost dizolvată în apă distilată. preparat și ajustat la pH 7 cu KOH. 2.7.4 Colorarea celulelor de drojdie cu colorant indicator În loc de celulele de drojdie din „Preis Microplan” utilizate de Klaus Kühle (1983), drojdia proaspătă de brutar a fost utilizată astfel încât să se poată omite prima etapă de centrifugare. Au fost efectuate următoarele etape pentru colorarea celulelor de drojdie cu colorant indicator: Suspendarea a 250 mg de drojdie proaspătă de brutar într-o eprubetă în 5,0 ml dintr-un tampon fosfat 1/15 M (Sørensen) pH 7,0. - Adăugarea a 25 mg albastru de bromimol (intervalul indicatorului pH 6,0-7,8; schimbarea culorii de la galben (acid) la albastru (bazic)) sau brom- 26
a b c d Fig. 4a-d: Captarea și transmiterea eritrocitelor în tractul digestiv al B. plicatilis. Secvență tipică după adăugarea de eritrocite la momentul 0, observată pe un rotifer care a fost ținut la deschiderea unui capilar din sticlă Pyrex prin aspirație. La această mărire nu a fost posibil să se fotografieze întregul animal în focalizare. Datorită mișcării animalelor în mediu, trebuiau selectați timpi scurți de expunere cu o deschidere mare. Bara de calibrare = 100 µm. a) După 10-20 de secunde, stomacul devine ușor roșu. b) După 180 de secunde stomacul este clar plin și se vede prima culoare a intestinului. c) După 15 minute stomacul și intestinul sunt colorate intens în roșu. d) După 17 minute, conținutul intestinului este expulzat prin anus. Procesele de trecere după primul proces au fost de obicei accelerate, astfel încât următoarea evacuare a intestinului a avut loc după doar 10 minute. În toate eritrocitele de mamifere utilizate (oameni, bovine și oi), în fecale se puteau vedea doar fragmente de membrană și norul de culoare roșie format din hemoglobina eliberată, care s-au dispersat rapid în mediu. În cazuri individuale care sunt încă vizibile în timpul primei mișcări intestinale, 30
Dacă astfel de probleme ar putea fi rezolvate, utilizarea fantomelor care au fost umplute cu substraturi de enzime fluorogene ar fi concepută pentru investigații ulterioare. Această metodă ar putea fi utilizată pentru a ex. Localizați enzimele din tractul digestiv. a b Fig. 5a-b: Fotografie în câmp luminos și fluorescență a unui rotifer la 5 minute după hrănire cu fantome care au fost umplute cu albumină marcată FITC (bara de calibrare = 50 µm). S-au adăugat 50 pl dintr-o suspensie cu fantome de albumină FITC la 500 pl de rotifere care conțin mediu. După preluarea particulelor timp de cinci minute, rotiferele au fost eliberate de fantomele de fluorescență libere prin clătirea lor de mai multe ori pe un filtru de nailon de 16 μm și o probă de animal a fost transferată pe o lamă cu o alunecare de acoperire. a) Imagine de fluorescență, b) Pentru a localiza fluorescența în tractul digestiv, imaginea a a fost inversată și plasată peste o imagine de câmp luminos a aceluiași animal. 33