Apoptoza keratinocitelor merge odată cu infiltrarea limfocitelor cd8 și acumularea

subiecte

abstract

Colorarea imunopatomorfologică a probelor de țesut permite evaluarea microscopică a detaliilor morfologice, a fenotipurilor și a prezenței markerilor de activare în celulele infiltrante. Prezența limfocitelor, în principal CD8 +, lângă celulele epiteliale ale pielii1 și prezența apoptozei cu o singură celulă sunt indicative ale GVHD acut.23 Regiunile de organizare nucleolară (NOR) ale celulelor bazale sunt puternic colorate în biopsiile cutanate Acumularea acută de GVHD .4-NOR caracterizează celulele din ciclul celular.5 A fost interpretat ca un semn al unei rate crescute de proliferare a keratinocitelor cutanate în leziunile acute GVHD. Acumularea NOR arată că celulele se află în ciclul celular, dar acest lucru nu poate fi completat cu o mitoză de succes. Dacă diviziunea celulară nu poate fi finalizată, procesul se încheie cu apoptoză

În lucrarea de față am investigat o relație între gradul de infiltrare a limfocitelor și prezența Ki67 + și a celulelor apoptotice în biopsiile cutanate obținute de la pacienții cu GVHD acut. În plus, au fost evaluate PCNA, ciclina A și pozitivitatea ciclului de diviziune celulară 2 (cdc2) a keratinocitelor. Această analiză complexă a arătat o afectare a ciclului de creștere a keratinocitelor la pacienți după BMT, care este probabil să promoveze procesele apoptotice asociate cu gradul de infiltrare locală a celulelor CD8 +.

Pacienți și metode

Rabdator

Optsprezece cazuri (10 adulți și 8 copii) cu leucemie mieloidă cronică (n = 6), leucemie acută și sindrom mielodisplazic (n = 7), anemie aplastică și anemie Fanconi (n = 5) au fost identificate fie cu BM (12 pacienți), fie cu cu PBPC (5 pacienți). Un pacient (LMC) a primit PBPC de la mama sa (transplant alternativ de donator) (Tabelul 1).

Regimul de condiționare a constat din busulfan (BU) 4 mg/kg greutate corporală și ciclofosfamidă (CY) 50 mg/kg greutate corporală, administrat în 4 zile (doză totală 16 mg/kg greutate corporală și 200 mg/kg greutate corporală BU sau CY) pentru opt pacienți cu leucemie cu risc standard sau BU 4 mg/kg greutate corporală timp de 4 zile (doză totală 16 mg/kg greutate corporală) și CY 60 mg/kg timp de 2 zile (doză totală 120 mg/kg greutate corporală), suplimentat cu 5-15 mg/kg greutate etopozidă în 2 Zile (doza totală 10-30 mg/kg greutate corporală) sau 250 mg/m2 de tiotepa în 3 zile (doza totală 750 mg/m2) la trei sau doi pacienți cu risc scăzut. Cazurile de FA au primit 5-15 mg/kg greutate corporală globulină anti-timocit (ATG, Fresenius, Bad Homburg, Germania) timp de 5 zile consecutive (doză totală 25-75 mg/kg greutate corporală) și CY 20 mg/kg greutate corporală, administrat în 4 zile (doza totală 80 mg/kg greutate corporală). Pacienții cu SAA au primit CY în doză de 50 mg/kg greutate corporală în 4 zile (doză totală 200 mg/kg greutate corporală) și 5 mg/kg greutate corporală ATG în 5 zile (doză totală 25 mg/kg greutate corporală) (Tabelul 1).

Profilaxia acută cu GVHD a inclus ciclosporină A (CsA) pentru a reduce nivelurile serice între 100 și 200 ng/ml și metotrexat (MTX) la o doză de 10 mg/m2 sau 5 mg/m2 (numai pacienți cu SAA) în zilele + Atingeți 1, +3, +6 și +11. MTX a fost întrerupt în două cazuri din cauza toxicității mucoasei sau a ficatului. Toxicitatea a fost evaluată în conformitate cu criteriile standard ale OMS. Simptomele acute ale GVHD au determinat începerea tratamentului cu prednison de la o doză de 2 mg/kg greutate corporală, care a fost crescută la intervale de 2 zile dacă nu a apărut nicio reacție.

Biopsiile pielii normale din patru cazuri (cu vârste cuprinse între 15 și 49 de ani) care au suferit o intervenție chirurgicală toracică pentru boli non-maligne și neinflamatorii au fost utilizate ca controale pentru studiile de marker ale ciclului de creștere. Marcarea ganglionilor limfatici cu leziuni metastatice a documentat capacitatea anticorpilor ciclinei A, cdc2 și Ki67 de a detecta celulele din ciclul celular (nu este prezentat).

Metode

Biopsiile cutanate au fost luate la primele semne ale leziunilor cutanate înainte sau a doua zi (cu excepția unui caz) după administrarea prednisonului (Tabelul 1).

Secțiunile colorate cu H + E au fost punctate conform criteriilor publicate pentru leziunile acute GVHD7 și apoptotice.8 Infiltrarea celulelor mononucleare a fost marcată după cum urmează: mai puțin de cinci celule într-un cluster, grad 0; 6-20 celule într-un cluster, gradul 1; 21 până la 50 de celule într-un cluster, gradul 2; O focalizare conține mai mult de 50 de celule într-un grup, gradul 3 și mai multe focalizări în țesut, gradul 4.

analize statistice

Testul Mann-Whitney U, testul exact Fisher și testul Student t pentru probele asociate au fost utilizate pentru a evalua statistic rezultatele.

Rezultate

Biopsii cutanate secvențiale (secțiuni înghețate) de la un pacient cu GVHD acut rezistent la steroizi (UPN 88). Numărul atât al celulelor epiteliale Ki67 +, cât și al celulelor apoptotice a crescut atunci când GVHD acut a fost complet crescut (+17 zile față de +31 zile după BMT) și a scăzut din nou în etapa finală. GVHD acut (+45 de zile după BMT) (mărire originală × 400) .

Secțiunile blocului de parafină GVHD acut grad III colorate pentru proteinele asociate ciclului celular și celulele apoptotice. Vă rugăm să rețineți o acumulare de antigen Ki67, PCNA și ciclină A în nucleele celulare mărite, lipsa celulelor pozitive Cdc2 și un număr de celule apoptotice într-un strat bazal al epiteliului (mărire originală × 400).

Au fost numărate celulele pozitive Ki67 și s-a evaluat gradul de colorare. Fracțiunea celulelor Ki67 + din stratul bazal al epidermei a fost similară în ambele probe cu și fără celule apoptotice (valori mediane: 0,25 vs. 0,2). Cu toate acestea, colorarea Ki67 + a fost mult mai puternică în secțiunile de țesut cu celule apoptotice prezente. Nucleii celulari au fost mai mari și mai puternic marcați cu Ki67 MoAb decât biopsiile fără apoptoză (Figurile 1 și 2). Această imagine a fost văzută în șapte din cele nouă probe cu celule apoptotice și doar una din nouă în secțiuni de țesut fără apoptoză (P = 0,008) (Tabelul 4).

Biopsiile cutanate secvențiale au arătat că atât numărul de celule Ki67 +, cât și celulele apoptotice au crescut pe măsură ce GVHD acut a progresat. Celulele Ki67 + din GVHD acut avansat au fost grupate focal. În GVHD acut în stadiul final, atât celulele Ki67 + cât și celulele apoptotice au scăzut odată cu scăderea numărului de celule epidermice (Figura 1). Colorarea PCNA a urmat modelul Ki67, care a fost ușor mai mic în biopsiile cu leziuni toxice, spre deosebire de pielea acută cu GVHD (neprezentată).

Pacienții au fost grupați în funcție de rezultatele colorării TUNEL (Tabelul 1). Grupul 1 a constat din pacienți cu celule apoptotice și Grupul 2 din pacienții fără celule apoptotice în biopsiile cutanate. Pacienții cu celule apoptotice în biopsiile cutanate au fost mai în vârstă decât pacienții fără celule apoptotice (medie ± sem .: 24, 8 ± 3, 7 vs. 15, 2 ± 3, 4 ani; P = 0,042) și mai frecvent au primit condiționări mai toxice, căruia i-a aparținut etopozidul sau tiotepa (4/9) vs 1/9, NS) (Tabelul 1). Ambii factori ar fi putut contribui la complicații toxice grave ale mucoasei care apar mai frecvent în grupul 1 decât în grupul 2 (P = 0,013) (Tabelul 1). Toți pacienții cu colorare pozitivă a pielii pentru celulele apoptotice (grupa 1) au îndeplinit criteriile histopatologice și clinice ale GVHD acut. Chiar și în stadiul GVHD acut, aceștia au fost mai avansați decât pacienții din grupul 2 (P = 0,015) (Tabelul 1).

Șase GVHD acute, două biopsii cutanate cu leziuni toxice și patru probe de piele martor ar putea fi examinate pentru colorarea proteinelor asociate ciclului de creștere în secțiunile blocului de parafină. În toate cele opt eșantioane (indiferent dacă au avut leziuni GVHD acute sau toxice), frecvența celulelor cu ciclină pozitivă A a fost mai mare decât cea a celulelor cdc2-pozitive (32% față de 8%; P = 0,072) (2 ) spre deosebire de pielea normală, care a fost caracterizată prin proporții similare de celule pozitive cu ciclină A și cdc2 (3). Prevalența ciclinei pozitive versus celulele cdc2 pozitive a fost observată în biopsiile cu GVHD acut, indiferent de rezultatele colorării TUNEL. Cu toate acestea, acumularea ciclinei A a fost observată în toate cele patru biopsii cu celule apoptotice, dar nu și în pielea normală sau bolnavă fără celule apoptotice (opt biopsii) (2 și 3). Modelul de colorare a ciclinei A a fost similar cu cel al Ki67. La fel s-a observat și cu ciclina A când s-a acumulat proteina Ki67 (2).

Secțiunile normale de bloc de parafină ale pielii se colorează așa cum este descris în Figura 2. Trebuie remarcat faptul că prevalența PCNA în comparație cu celulele Ki67 + este pozitivă, că celulele pozitive ale ciclinei A și Cdc2 sunt prezente în proporții egale și că stratul epitelial superior este maroniu (colorarea celulelor apoptotice) nucleii apoptozei (original Mărire × 400).

discuţie

Numărul de celule apoptotice a fost scăzut și au fost observate la pacienții cu toxicitate mai pronunțată a mucoasei și/sau a pielii. Acestea au fost asociate cu severitatea GVHD acută și gradul de infiltrare a limfocitelor în piele, dar nu și cu prezența limfocitelor în epidermă. Apoptoza face parte din imaginea GVHD acută completă, care include afectarea țesuturilor și infiltrarea limfocitelor (Tabelul 2).

Se pare că afectarea pielii la pacienții după BMT este un proces în doi pași. O insultă genotoxică afectează inițial ciclul celular și duce la un defect la limita G 2/M. În ciuda proporției relativ mari de celule care sunt fie Ki67- (Figura 2), fie AgNOR-pozitive, acest lucru duce la o rată mitotică scăzută a keratinocitelor.4 Această situație face ca celulele să fie susceptibile la moarte apoptotică. Mecanismul prin care lovitura apoptotică finală este administrată keratinocitelor nu poate fi dedusă din prezentul studiu, dar este probabil să fie asociată cu infiltrarea limfocitelor. Mai degrabă, acest lucru se poate datora unei eliberări locale de citokine inflamatorii, care pot avea un potențial de stopare a creșterii (de exemplu, TNFα) 22, dar nu unui atac direct de limfocite dependente de enzime. Granzyme induce moartea apoptotică și necesită activitate cdc2 kinazei 19, dar pare a fi absentă în piele după BMT.