Aspergillus niger în otomicoză Cine sunt bărbații în negru în otomicoză PDF Descărcare gratuită
Teză Aspergillus niger în otomicoză Cine sunt bărbații în negru în otomicoză? prezentat de Marcel Schöpfer Mat.Nr.: 0412267 pentru obținerea diplomei universitare de doctor în medicină (Dr.med.univ.) la Universitatea de Medicină din Graz Examinator: conf. univ. Priv.-Doz. Ing. Mag. Dr. Walter Buzina, Institutul de Igienă, Microbiologie și Medicină de Mediu Univ. Prof. Dr. Doris Lang-Loidolt, Clinica Universitară pentru ORL Graz Graz, iulie 2011
Declarație de onoare Declar pe onoarea mea că am pregătit eu însumi această lucrare științifică și că am desfășurat eu însumi activitățile legate direct de aceasta. De asemenea, declar că nu am folosit alte ajutoare decât cele specificate. Am observat toate drepturile de autor și contractuale ale surselor de literatură utilizate, am folosit doar sursele indicate și am marcat pasajele luate textual sau în ceea ce privește conținutul ca atare din sursele utilizate. Sprijinul oferit în timpul procesului de lucru, inclusiv instrucțiuni semnificative de mentorat, este specificat integral. Această teză a fost trimisă în format tipărit și electronic și nu a fost încă trimisă niciunei alte autorități de examinare. Graz, iulie 2011 (Marcel Schöpfer)
Mulțumiri Aș dori să mulțumesc tuturor celor care m-au ajutat să realizez această lucrare: Institutul de igienă, microbiologie și medicină de mediu și Clinicile universitare de medicină pentru urechi, nasuri și gât din Graz și Innsbruck pentru furnizarea echipamentelor și materialelor necesare. Ass.-Prof. Priv.-Doz. Ing. Mag. Dr. Walter Buzina și prof. Univ. Dr. Doris Lang-Loidolt pentru supravegherea științifică. Toți colegii, în special Bettina Heiling, pentru sprijinul lor practic. Mag. Peter Tschuffer pentru corectarea acestei lucrări. Fratele meu Patrick pentru asistență grafică și tehnică. Părinții mei iubitori, Werner și Elfriede, pentru însoțirea și sprijinul pacientului pe tot parcursul studiului medicinii umane și pentru a face posibilă o fază importantă și de neînlocuit a vieții. Nașului meu, Dr. Helmut Schöpfer, fără de care nu aș fi studiat niciodată medicina.
Cuprins 1. Introducere. 1 1.1 Istorie. 1 1.2 Ce sunt otomicozele. 4 1.3 Anatomia și histologia canalului auditiv extern. 6 1.4 Biologia ciupercilor. 9 1.4.1 Clasificare și nomenclatură. 9 1.4.2 Sistem D-H-S: clasificarea ciupercilor importante din punct de vedere medical. 11 1.4.3 Structura celulei de ciuperci. 12 1.4.4 Fiziologie. 14 1.4.5 Condițiile de viață și stilul de viață al ciupercilor importante din punct de vedere medical. 15 1.4.6 Micopatii. 17 1.5 Scopul lucrării. 18 2. Material și metode. 20 2.1 Etape de lucru. 20 2.2 Materiale de probă. 20 2.3 Medii de cultură. 21 2.4 Identificarea biologică moleculară. 21 2.4.1 Izolarea ADN-ului. 22 2.4.2 PCR. 22 2.4.3 Secvențierea ADN-ului. 25 2.4.4 Analiza secvenței și baza de date. 26 3. Rezultate. 27 3.1 Morfologie. 27 3.2 Rezultate biologice moleculare. 31 3.2.1 Izolarea ADN și PCR. 32 3.2.2 Secvențierea ADN-ului. 33 3.3 Dosarele medicale. 57 3.4 Evaluarea statistică a datelor demografice ale tuturor descoperirilor fungice pozitive din ureche (2006-2010). 63 4. Discuție. 67 4.1 Discuție biologică. 67 4.2 Discuție clinică. 69 5. Rezumat. 74 6. Rezumat. 76 7. Literatura. 77 Anexă. 81
Abrevieri A. d. Aqua distillata, apă distilată bp pereche de baze ddntp dideoxinucleotid trifosfat dntp deoxinucleotid trifosfat ADN Acid dezoxiribonucleic, acid dezoxiribonucleic EDTA acid etilendiaminetetraacetic Eppi 1,5 ml vas de reacție EtBr etidiu acid bromic ETS reacție transcrisă internă spațiat minut forța centrifugă RT temperatura camerei de la A. Aspergillus Taq Thermus aquaticus GG canalul urechii drepte. dreapta stanga ARN stâng acid ribonucleic bt2a/b primer tubulin o. B. fără constatări sp./spp. Specii/Mai multe specii
Membrana timpanică (Membrana tympanica) Membrana timpanică este o piele tendinoasă între canalul auditiv extern și cavitatea timpanică cu o structură în trei straturi, este granița dintre urechea externă și cea medie. Aspergillus niger în otomicoze 8
2. Material și metode 2.1 Etape de lucru Organigrama etapelor de lucru, care va fi discutată mai detaliat mai jos: Cerere comitetului de etică cu vot în anexă Ambulanță ORL + frotiuri ale canalului auditiv extern folosind tampoane Cultivarea frotiurilor pe medii bacteriologice și micologice Identificare morfologică Supra-vaccinare Identificare biologică moleculară: Izolare a ADN-ului după 24 de ore ITS-PCR TS-secvențierea tubulinei pentru o diferențiere mai precisă între două tipuri 2.2 Materiale de probă Au fost eligibile pentru studiu persoanele diagnosticate cu o infecție a urechii în ambulatoriile din Clinicile Universitare ORL din Graz și Innsbruck. După ce participanții la studiu au fost informați și și-au dat consimțământul, frotiurile au fost luate din canalul auditiv extern folosind tampoane (tampoane de transport sterile Copan). Aspergillus niger în otomicoze 20
ciuperci len folosite. Variația regiunii ITS necodificatoare este utilizată pentru a face diferența între genuri și populații. Pentru reacția PCR, se prepară mai întâi un amestec principal în care sunt conținute toate componentele (perechea de primer, cele patru nucleotide, tampon și ADN polimerază), cu excepția ADN-ului. 18,8 μl din aceasta sunt pipetați în lanțuri de vase de reacție de 0,2 ml și 1,2 μl de ADN sunt adăugați la fiecare. Un control pozitiv și unul negativ sunt incluse cu fiecare lot. Pentru a diferenția cu precizie între Aspergillus tubingenisis și Aspergillus foetidus, gena tubulinei a fost amplificată și secvențiată cu primerii bt2a și bt2b. Aspergillus niger în otomicoze 23
3. Rezultate 3.1 Morfologie Culturile au fost supuse mai întâi controlului macroscopic și microscopic (Figurile 2-7). Nici o diferențiere nu a putut fi făcută din partea noastră. Aspergillus niger în otomicoze 27
Figura 2: Cultura Aspergillus foetidus pe Sabouraud Figura 3: Aspergillus foetidus microscopic Aspergillus niger în otomicoze 28
Figura 4: Cultura Aspergillus niger pe Sabouraud Figura 5: Aspergillus niger microscopic Aspergillus niger în otomicoze 29
Figura 6: Cultura Aspergillus tubingensis pe Sabouraud Figura 7: Aspergillus tubingensis microscopic Aspergillus niger în otomicoze 30
Nu s-au putut găsi diferențe semnificative între speciile individuale de Aspergillus. 3.2 Rezultate biologice moleculare Deoarece nu au existat diferențe vizibile macroscopic sau microscopic între Aspergillus negru, am urmărit o identificare biologică moleculară cu ajutorul regiunii variabile și necodificatoare ITS a ADN-ului ribozomal și a genei tubulinei pentru multe ciuperci. ADN-ul a fost izolat de ciupercile noastre și analiza secvenței a început după PCR. Aspergillus niger în otomicoze 31
3.2.1 Izolarea ADN-ului și PCR Primul pas de control pentru un PCR de succes a fost gelul de agaroză cu produsele noastre PCR. Purificarea și secvențierea ar putea fi începute cu acele probe ale căror benzi erau clar vizibile. Figura 8: Gel de agaroză al produselor PCR (ITS), colorat cu EtBr Figura 9: Gel de agaroză al produselor PCR (-Tubulină), colorat cu EtBr Aspergillus niger în otomicoze 32
3.2.2 Secvențierea ADN regiunii ITS S-au folosit ca referință tulpinile CBS ale Aspergillus niger (CBS 554.65), Aspergillus foetidus (CBS 56465) și Aspergillus tubingensis (CBS 134.48). Aspergillus niger s-a distins de Aspergillus foetidus și Aspergillus tubingensis pe baza diferențelor de bază din G 56 A, C 109 T, C 514 T (alinierea vezi mai jos). S-a căutat o diferențiere între ultimele două pe baza genei care codifică tubulina. Aspergillus niger în otomicoze 33
3.3 Dosare medicale La 15 pacienți, pe lângă identificarea biologică moleculară exactă, constatările fungice au fost comparate retrospectiv cu constatările clinice. Datele provin din rețeaua de comunicare și informare clinică MEDOCS. Aspergillus niger în otomicoze 57
3.4 Evaluarea statistică a datelor demografice ale tuturor descoperirilor fungice pozitive din ureche (2006-2010) Evaluarea statistică a tuturor descoperirilor fungice pozitive din ureche în perioada 2006-2010 din laboratorul micologic al Institutului de igienă, microbiologie și medicină de mediu a arătat 425 de rezultate fungice pozitive din 360 Rabdator. Au fost găsite în total 478 de ciuperci, care pot fi atribuite aparițiilor repetate ale pacienților individuali și prezenței unor constatări mixte sau multiple. Ciupercile găsite au inclus 28 de specii diferite. În analiza noastră, parapsiloza Candida a fost găsită cel mai frecvent în canalul urechii, urmată de A. niger sensu lato. (Tabelul 6, figurile 10 și 11) Aspergillus niger în otomicoze 63
Tabelul 6: Spectrul fungilor (2006-2010) Numele numelui germenului/numele germenului% pe baza numărului/denumirii germenilor Candida parapsilosis 139 29,08% Aspergillus niger 97 20,29% Aspergillus fumigatus 85 17,78% Candida albicans 83 17,36% Aspergillus flavus 23 4,81% Pseudallescheria boydii 7 1,46% Candida glabrata 6 1,26% Candida lusitaniae (Clavispora lusitaniae) 4 0,84% Ciuperci 3 0,63% Scopulariopsis brevicaulis 3 0,63% Aspergillus candidus 3 0,63% Trichophyton mentagrofite 2 0,42% Candida non-albicans 2 0,42% Candida guilliermondii (Pichia guilliermondii) 2 0,42% Aspergillus sclerotiorum 2 0,42% Miceliu steril 1 0,21% Scopulariopsis sp. 1 0,21% Scedosporium apiospermum 1 0,21% Paecilomyces sp. 1 0,21% Microsporum canis 1 0,21% Exophiala dermatitidis 1 0,21% Chrysosporium queenslandicum 1 0,21% Candida utilis 1 0,21% Candida tropicalis 1 0,21% Candida magnoliae 1 0,21% Candida famata 1 0,21% Candida ciferrii (Stephanoascus ciferrii) 1 0,21% Aspergillus terreus 1 0,21% Aspergillus sydowii 1 0,21% Aspergillus sp. 1 0,21% Aspergillus oryzae 1 0,21% Aspergillus glaucus 1 0,21% Total 478 100% Aspergillus niger în otomicoze 64
Ciuperci de fir (n = 233) vs. Ciuperci (n = 245) (n = 478) Ciuperci 49% Ciuperci 51% Figura 10: Diagrama filamentului vs. Ciuperci ale tuturor descoperirilor fungice pozitive (2006-2010) Ciuperci filamentoase în procente (n = 233) 10% 36% 12% 42% Aspergillus niger Aspergillus fumigatus Aspergillus flavus Altele Figura 11: Diagrama ciupercilor filamentoase ale tuturor descoperirilor fungice pozitive (2006-2010) Aspergillus niger în otomicoze 65
Distribuția de gen (n = 360) de sex feminin 43% bărbați 57% Figura 12: Distribuția de gen a pacienților cu toate rezultatele fungice pozitive (2006-2010) Pacienții de sex masculin s-au confruntat mai frecvent cu constatări fungice la nivelul urechii. Cu toate acestea, rezultatele nu pot fi urmărite înapoi la otomicoze diagnosticate și oferă doar o imagine de ansamblu asupra ciupercilor găsite în ureche în ultimii cinci ani. Distribuția în funcție de vârstă a rezultatelor fungice pozitive în% (n = 360) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 18 18 16 13 13 8 8 3 4 0-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61 -70 71-80> 80 Figura 13: Distribuția în funcție de vârstă a pacienților cu toate rezultatele fungice pozitive (2006-2010) Vârsta medie a fost de 52,3 ani, cu o mediană de 52 și o deviație standard de 19,88 ani. Grupurile de vârstă de la 41 la 50 de ani și de la 51 la 60 de ani (18% fiecare) s-au confruntat cel mai frecvent cu descoperiri fungice pozitive. Aspergillus niger în otomicoze 66
ca și în cazul unei drojdii au fost la fel de prezente ca o singură prezență a Aspergillus niger. În cele din urmă, au fost verificate descoperirile fungice (din ureche) din ultimii cinci ani în zona mai mare a Graz. Din 425 de rezultate fungice pozitive și 360 de pacienți, am găsit o majoritate restrânsă în favoarea drojdiilor (51%) comparativ cu ciupercile filamentoase (49%). Izolatul predominant dintre cele 28 de specii diferite a fost Candida parapsilosis (29%), a doua cea mai frecventă și, prin urmare, cea mai frecventă mucegai a fost Aspergillus niger sensu lato (20%). Vârsta medie a fost de 52,3 ani (valoare mediană: 52) cu o abatere standard de 19,88 ani. Grupurile de vârstă de la 41 la 50 de ani și de la 51 la 60 de ani (18% fiecare) s-au confruntat cel mai frecvent cu descoperiri fungice pozitive. Bărbații (57%) s-au confruntat cu un rezultat fungic pozitiv mai des decât femeile (43%). Aspergillus niger în otomicoze 75