Clorura de vinil și dieta bogată în grăsimi ca model de protocol de interacțiune cu mediul și obezitatea

rezumat

Scopul acestui protocol a fost de a dezvolta un model murin de expunere toxică la nivel scăzut care nu provoacă leziuni hepatice evidente, ci mai degrabă exacerbează leziunile hepatice preexistente. Această paradigmă recapitulează mai bine expunerea umană și modificările subtile care apar la expunerea la concentrații toxice despre care se crede că sunt sigure.

Abstract

Clorura de vinil (VC), un poluant din mediu abundent, provoacă niveluri ridicate de steatohepatită, dar este considerată sigură la concentrații mai mici. Deși mai multe studii au examinat rolul VC ca agent hepatotoxic direct, conceptul că VC crește sensibilitatea ficatului la alți factori, cum ar fi ficatul gras nealcoolic (NAFLD) cauzat de dietele bogate în grăsimi (HFD), este nou. Acest protocol descrie o paradigmă a expunerii pentru evaluarea efectelor expunerii cronice și scăzute la VC. Șoarecii sunt vaccinați pe o dietă cu conținut scăzut de grăsimi sau cu conținut ridicat de grăsimi timp de o săptămână înainte de începerea expunerii prin inhalare și rămân pe această dietă pe tot parcursul experimentului. Șoarecii sunt VC (nivel sub-OSHA:

Introducere

Principala cale de expunere pentru multe toxine și poluanți din mediu este prin inhalare. După inhalare, compusul poate intra în circulația sistemică prin plămâni, poate intra în ficat și poate fi activat metabolic de enzimele hepatice înainte de a fi excretat 14, 15, 16. Adesea acești metaboliți activi sunt cei care provoacă toxicitate și daune în organism. Studiile anterioare ale acestui grup și alții au folosit metaboliții VC ca înlocuitori pentru expunerea la gazul VC 17, 18. Alte grupuri au folosit modele de inhalare a VC; cu toate acestea, au fost puse în aplicare niveluri extrem de ridicate de expunere (> 50 ppm) pentru a induce toxicitate acută, leziuni hepatice severe și dezvoltarea tumorii 19. În timp ce aceste studii au furnizat informații importante și mecanisme ale carcinogenității induse de VC, ele nu recapitulează efectele subtile și interacțiunile complexe cu alți factori care contribuie și, prin urmare, sunt mai puțin relevante pentru expunerea umană.

Modelul de inhalare VC plus High Fat Eat (HFD) descris aici (vezi Figura 1 pentru cronologie) este primul model de expunere cronică la doze mici VC (adică, concentrație sub-OSHA) în care șoarecii sunt expuși toxinei în condiții care imită mult mai mult expunerea umană. Într-adevăr, datele din acest model au recapitulat rezultatele observate la VC la om, cum ar fi efectele asupra căilor metabolice 20, stresul oxidativ și disfuncția mitocondrială 4. Alte modele de șoareci de inhalare, cum ar fi B. Modelele de cap și nas 21 necesită ca animalul să fie reținut, provocând stres animalului. Aici, această metodă de expunere a întregului corp nu necesită nicio injecție sau stres inutil pentru animale. Animalele au acces ad libitum la alimente și apă și sunt plasate în camera de inhalare mai mare pentru un anumit număr de ore pe zi și zi pe săptămână. În plus, conceptul că VC modifică sensibilitatea la un alt agent hepatotoxic este o descoperire nouă detectată pentru prima dată de acest grup 12 și are un impact asupra expunerii la VC la concentrații mult sub cele pentru hepatotoxicitatea directă. necesare sunt.

Această metodă de expunere prin inhalare poate fi utilizată pentru a imita expunerea la o mare varietate de toxine gazoase, inclusiv alți compuși organici volatili, din mediul nostru. Într-adevăr, compușii organici volatili reprezintă un grup mare de poluanți ai mediului și sunt mai răspândiți în zonele industrializate, punând anumite populații la un risc mai mare de expunere cronică 22. Acest protocol poate fi adaptat la diferite întrebări experimentale. Durata și concentrația compusului administrat pot fi variate. Deși inițial dezvoltat pentru determinarea afectării ficatului, alte sisteme de organe pot și au fost investigate folosind acest model 23. Cercetătorii care studiază expunerile cronice la animale, dar care doresc să minimizeze stresul la animale, ar trebui să ia în considerare acest model.

Protocol

Toate experimentele pe animale/CV au fost aprobate de către Departamentul de sănătate a mediului, Asociația pentru siguranță pentru evaluarea și acreditarea îngrijirii animalelor de laborator, iar procedurile au fost aprobate de Comitetul instituțional local pentru îngrijirea și utilizarea animalelor.

1. Configurare experimentală și aclimatizare la diete experimentale purificate

NOTĂ: Există mai multe sisteme de expunere la inhalare disponibile în comerț, variind de la expunerea exclusiv la nas până la expunerea întregului corp și manual la sistemele automate. Datele publicate anterior de acest grup au fost derivate dintr-un sistem manual holistic 12, 23, 24. Figura 2Figura 12 este o diagramă care descrie sistemul automat de expunere prin inhalare.

4. Cusca de expunere si pregatirea animalelor

Scoateți șoarecii din camerele lor și plasați-le în cuștile individuale ale cuștii camerei de inhalare (un suport de cușcă pentru șoarecii de control, unul pentru șoarecii expuși). Randomizați plasarea fiecărui mouse în raftul cuștii zilnic pentru a vă asigura că fiecare mouse este expus omogen în camera de expunere. Marcați numărul și poziția cuștii fiecărui animal în caietul de laborator.
Așezați fiecare raft cușcă în camera respectivă și închideți ușile camerei.

5. Efectuarea unei expuneri

Rotiți robinetul pentru supapa rezervorului de gaz VC în poziția închis și opriți toate fluxurile de aer din camera de expunere. Rotiți rotametrul până când nu există flux de aer prin camera de control.
Scoateți ușile din fiecare cameră pentru a ventila șoarecii. Scoateți suporturile cuștii din camere. Scoateți șoarecii cu glugă din cuștile de expunere și plasați-le înapoi în cuștile lor. Transportați toți șoarecii înapoi în locuințele lor pentru cazare peste noapte în cuști obișnuite.
Aruncați toate deșeurile din tigaia de excrement într-un recipient aprobat de Departamentul de Sănătate și Securitate al Mediului (DEHS), deoarece acestea pot fi considerate un pericol chimic de către serviciile instituționale de sănătate a mediului. Curățați ușile camerei, tava de excreție, cușca de expunere și camera de expunere pentru sistemele experimentale și de control.

7. Validarea concentrației VC în camere în timpul expunerii

8. Încetarea experimentului de expunere la inhalare

NOTĂ: În funcție de timpul dorit de expunere, de ex. B. 6, 8 și/sau 12 săptămâni după începerea expunerii prin inhalare, experimentele sunt încheiate și animalele sunt eutanasiate (vezi Figura 1 pentru cronologie).

Rezultate reprezentative

Pe parcursul experimentului, greutatea corporală a animalelor și consumul de alimente au fost monitorizate săptămânal pentru a asigura sănătatea animalelor și pentru a evalua metabolismul in vivo. Figura 3A. arată greutatea corporală și consumul de alimente pentru un experiment de 12 săptămâni. Greutatea corporală a fost măsurată o dată pe săptămână și consumul de alimente de două ori pe săptămână pentru toate grupurile. Toți șoarecii s-au îngrășat pe parcursul studiului. În timp ce șoarecii din grupurile HFD au câștigat mai multă greutate decât șoarecii din grupurile LFD, așa cum era de așteptat, șoarecii expuși la VC nu au câștigat mai multă greutate decât șoarecii din grupul de control respectiv. Consumul de alimente nu a fost diferit în toate grupurile 12, 24.

Figura 3B. Figura 10 prezintă fotomicroscoape reprezentative ale secțiunilor hepatice colorate cu H&E pentru analiza morfologiei generale. În grupul LFD, VC nu a provocat modificări patologice anormale. Alimentarea cu HFD a crescut semnificativ steatoza (acumularea de grăsime) și expunerea la VC a crescut acest efect. În plus, expunerea la VC a dus la apariția unor puncte fierbinți inflamatorii în grupul HFD 12, 24 .

Nivelurile transaminazei plasmatice (ALT și AST) au fost măsurate ca indicatori ai afectării ficatului, iar nivelurile crescute ale transaminazelor sunt un indicator al afectării ficatului. În grupul LFD, transaminaza nu a crescut cu VC. HFD singur a crescut ușor nivelurile de transaminază și, mai presus de toate, VC a îmbunătățit semnificativ acest efect (Figura 3C.) 12, 24 .

Rapoartele de greutate hepatică și greutate corporală au fost calculate pentru fiecare grup. HFD a crescut semnificativ raportul dintre ficat și greutatea corporală. Cu toate acestea, VC nu a crescut semnificativ acest efect (Figura 3D.) 12 .

Figura 1: Prezentare generală a procedurii modelului de inhalare. Șoarecii sunt hrăniți cu diete ad libitum cu conținut scăzut de grăsimi (13% acizi grași saturați) sau 42% acizi grași saturați timp de 1 săptămână pentru a-i obișnui cu dieta purificată. După o săptămână, șoarecii sunt introduși în regimul de inhalare. În acest scop, șoarecii sunt așezați în camere de inhalare ultramoderne pentru expunerea la o concentrație de VC a nivelului sub-OSHA a, p, b, p

Discuţie

Acest model de NAFLD îmbunătățit cu VC este o metodă nouă de evaluare a efectului expunerii la VC prag sub-OSHA într-o paradigmă de inhalare a întregului corp. Acest model permite cercetătorilor să studieze efectele subhepatotoxice și sensibilizante de la niveluri scăzute de VC. Într-adevăr, acest model de co-expunere realizează leziuni hepatice îmbunătățite, creșteri ale ALT și AST plasmatice și inflamații moderate, deși nu afectează în mare măsură alte sisteme de organe, cum ar fi inima, la această concentrație. Acest model cronic necesită camere de inhalare a întregului corp, dar minimizează stresul și nivelurile de expunere. Deși protocolul prezentat aici este o abordare bazată pe software, experiența noastră a arătat că abordarea manuală este, de asemenea, o metodă precisă și consecventă de expunere 12, 24. În plus, se aplică cu ușurință mai multor domenii de cercetare, inclusiv alte leziuni ale organelor 23 cauzate de expunerea la compuși organici volatili 22. În special, acest model poate semăna mai mult cu patogeneza coexpunerii umane la substanțele chimice din mediu și cu boala care sta la baza ei 5 .

Pentru a obține rezultate similare, trebuie parcurși anumiți pași critici în optimizarea protocolului. De exemplu, evaluatorii trebuie să stabilească faptul că concentrația VC sau a altui agent toxic în camere este în intervalul de expunere dorit (adică niveluri scăzute, sub-OSHA sau acute). Optimizarea acestui pas al camerei de inhalare este esențială pentru un model de expunere de succes al interesului uman. În al doilea rând, ajustarea timpului de expunere pe zi și durata experimentului pot fi, de asemenea, modificate. În conformitate cu interesele acestui grup, a fost atinsă o expunere profesională și a fost examinat și un parametru suplimentar al dietei. Cu toate acestea, expunerile de mediu și acute pot fi, de asemenea, modelate cu acest protocol.

Această lucrare provoacă paradigma conform căreia limitele actuale de expunere a CV (ocupaționale și de mediu) sunt sigure. Deși limita actuală de expunere la OSHA pentru VC este de 1 ppm, acest model a demonstrat că concentrațiile de VC sub această limită sunt suficiente pentru ameliorarea leziunilor hepatice cauzate de HFD la șoareci. Acest protocol permite cercetătorilor să studieze și să caracterizeze o nouă paradigmă de expunere la toxici și să modeleze TASH.

Acesta este primul model de expunere cronică la doze mici de CV. Lucrările anterioare au folosit concentrații foarte mari de bolus, expuneri acute sau metaboliți activi ca înlocuitori pentru expunerea la VC. Toate aceste abordări reduc relevanța constatărilor pentru expunerea umană. Prin urmare, acest nou model de interacțiune TASH-NAFLD oferă platforma necesară cercetătorilor pentru a studia interacțiunile complexe de expunere redusă la VC.

Acest model de leziuni hepatice induse de toxici poate fi utilizat pentru alți compuși organici volatili și, de asemenea, pentru a studia alte interacțiuni care pot afecta ficatul și alte sisteme de organe 8, 22, 23. În plus, acest model a fost și poate fi utilizat în continuare pentru a investiga terapiile de intervenție și studiile mecanice aprofundate ale modului de acțiune pentru acest agent toxic predominant 24. Deoarece VC este un cancerigen cunoscut 26, 27, 28, această paradigmă de expunere poate fi modificată și pentru studiul cancerului indus de VC. Alte comorbidități, cum ar fi boala hepatică alcoolică, pot fi, de asemenea, exacerbate de co-expunerea la VC. În plus, ar fi de interes să se studieze diferite tipuri de grăsimi, cum ar fi acizii grași polinesaturați 18, 29, 30 sau diferite tipuri de carbohidrați 31 și co-expunerea lor la VC în acest model. De fapt, se cunoaște că toți acești factori au efecte diferite asupra dezvoltării leziunilor hepatice și pot juca un rol în boala hepatică indusă de VC.

În rezumat, acesta este un nou model de inhalare pentru leziuni hepatice toxice pentru mediu și stabilește o paradigmă de expunere pentru expunerea cronică, la VC scăzută. Concentrația VC utilizată în acest model este subhepatotoxică de la sine, în timp ce îmbunătățește leziunile hepatice cauzate de un alt factor (HFD) la șoareci. Acest model va permite cercetătorilor să studieze mecanismele și intervențiile pentru toxicitatea cronică a CV și poate fi util pentru studiile translaționale care examinează subiecți expuși la oameni care prezintă cel mai mare risc de expunere.

Dezvăluiri

WT Goldsmith are un interes financiar în IEStechno, șablonul pentru sistemul descris. Ceilalți autori nu au nimic de dezvăluit.

Mulțumiri

Acest studiu a fost finanțat de premiile acordate de Institutele Naționale de Sănătate (K01 DK096042 și R03 DK107912) către Juliane Beier. Cercetarea a fost, de asemenea, susținută de un Premiu pentru Dezvoltare Instituțională (IDeA) de la Institutul Național de Științe Medicale Generale către Institutele Naționale de Sănătate cu numărul de subvenție P20GM113226 și de la Institutul Național pentru Abuzul de Alcool și Alcoolism al Institutelor Naționale de Sănătate cu numărul de atribuire P50AA024337. Conținutul este responsabilitatea exclusivă a autorilor și nu reprezintă în mod necesar opiniile oficiale ale Institutelor Naționale de Sănătate.