Componentele alimentare și influența lor asupra patogeniei diabetului autoimun la om și
Catedra TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN pentru fiziologie nutrițională Componentele alimentare și influența lor asupra patogeniei diabetului autoimun la om și șoareci Daniela Bettina Müller Copie completă a tezei de doctorat aprobată de Centrul științific Weihenstephan pentru nutriție, utilizare a terenurilor și mediu de la Universitatea Tehnică din München. Doctor în științe gospodărești și nutriționale Președinte: examinator al disertației: prof. Univ. Dr. J. J. Hauner 1. Prof. univ. Dr. H. Daniel 2a apl. Prof. Dr. A-G. Ziegler Disertația a fost trimisă la Universitatea Tehnică din München pe 5 ianuarie 2010 și acceptată de Centrul Științific Weihenstephan pentru Nutriție, Utilizarea Terenului și Mediu în 25 februarie 2010.
Pentru cei doi bunicii mei
Cuprins Cuprins 1 Sarcină. 1-3 2 Introducere și revizuirea literaturii. 4-23 2.1 Bazele diabetului de tip 1. 4 2.1.1 Importanța geneticii. 5-6 2.1.2 Patogenie și fond imunologic al diabetului de tip 1. 6-8 2.2 Grâul și fracțiunile sale proteice. 8-9 2.2.1 Boala celiacă și asocierea dintre diabetul de tip 1 și boala celiacă. 10-14 2.2.2 Influența proteinelor din grâu asupra dezvoltării diabetului autoimun la modelele animale. 14 2.2.3 Modele animale de diabet de tip 1. 14-15 2.2.4 Influența factorilor dietetici asupra dezvoltării diabetului autoimun la modelele animale. 16 2.3 Laptele de vacă și fracțiunile sale proteice. 17-18 2.3.1 Influența proteinelor din laptele de vacă asupra dezvoltării diabetului autoimun la modelele animale. 18-19 2.4 Influența grâului și a laptelui de vacă în diabetul de tip 1 uman. 19-21 2.5 Asocierea între sistemul imunitar asociat intestinului și diabetul autoimun. 21-22 2.6 Alte componente alimentare și posibila lor asociere cu diabetul de tip 1. 22-23 3 Material și metode. 24-41 3.1 Investigații pe modelul mouse-ului NOD. 24 3.1.1 Șoareci colectivi. 24 3.1.2 Dietele. 24-27 3.1.3 Experiment parțial protocol 1 și 1a. 27-29 3.1.4 Experiment parțial protocol 2. 29-30 3.1.5 Experiment parțial protocol 3. 31 I.
Cuprins Cuprins. Lista figurilor. Lista de mese. Lista de abrevieri. I-V VI-VIII IX-X XI Publicații anterioare. XII curriculum vitae. XIII-XIV mulțumire. XV V
Lista figurilor Fig. 26 Legarea IAA de lapte, proteine din lapte, formule și grâu în comparație cu insulina umană. 74 Fig. 27 Curbele de legare ale IAA de componentele alimentare 75 Fig. 28 Curbele de legare ale IAA de proteinele din lapte. 76 Fig. 29 Legarea IAA la diferite proteine din lapte în comparație cu insulina (partea 1). 77 Fig. 30 Legarea IAA la diferite proteine din lapte în comparație cu insulina (partea 2). 78 Fig. 31 Legarea IAA la diferite proteine din lapte în comparație cu insulina (partea 3). 79 VIII
Lista tabelelor Tab. 20 Analiza concentrației de proteine a soluțiilor alimentare extrase în diferite diluții și a valorilor medii rezultate. 66-67 Tab. 21 Caracteristicile persoanelor testate ale căror IAA se leagă de extractul de lapte praf. 73 X
Lista abrevierilor Lista abrevierilor Fig. Figura AK Anticorp Asp asparagină cpm se dezintegrează radioactiv pe minut (număr pe minut) GAD (A) (anticorpi împotriva) glutamatului decarboxilază Complexul de histocompatibilitate HLA (antigenul leucocitului uman) I (A) A Anticorpul de insulină (auto) IA-2 (A ) (Anticorpi împotriva) proteinei tirozin fosfatazei IA-2 ICA anticorpi cu celule insulare Ig imunoglobulină MHC complexul principal de histocomabilitate min. Proces-verbal n.a. necunoscut NOD diabetic nonobez RBA radioligand test de legare rpm runde pe minut T1D diabet tip 1 Tab. Tabel TBST soluție salină tamponată Tris plus Tween TBT Tris tamponată Tween t-tg țesut-tranglutaminază vs. versus Organizația Mondială a Sănătății OMS ZnT8 Zinc Transporter 8 XI
Să poată stabili sarcini care ar putea fi considerate potențiale antigene țintă inițiale ale IAA. În general, această lucrare ar trebui să stabilească influența posibilă a componentelor alimentare individuale asupra procesului imun al diabetului autoimun. Utilizând datele obținute in vivo pe modelul NOD, componentele alimentare potențial diabetogene sunt testate pe seruri umane. Folosind aceste modele in vitro, se va investiga în ce măsură evenimentele imune ale diabetului de tip 1 ar putea fi inițial declanșate de reacțiile încrucișate cu componentele alimentare. Rezultatele acestor experimente ar putea descrie alte mecanisme necunoscute anterior ale patogenezei diabetului și, astfel, pot fi utilizate pentru dezvoltarea terapiilor primare pentru a preveni dezvoltarea diabetului de tip 1 în copilăria timpurie. 3
Material și metode (dieta D), un al doilea grup a rămas pe dieta care conține grâu A și un al treilea grup a rămas pe dieta fără grâu B. Puii de sex feminin din grupul de reproducere al dietei fără gluten și fără cazeină C au fost repartizați la un grup de testare format din vârsta de 9 săptămâni animale femele care au rămas în dieta C (vezi Fig. 4). Perechi de reproducție Dieta fără gluten, care conține cazeină B Dieta fără gluten și cazeină C Grupuri de test Dieta B n = 12 Dieta A n = 12 Dieta D n = 12 Dieta C n = 9 Fig. 4 Alocarea șoarecilor femele NOD la grupele de reproducere și test în testul parțial 1. Tinerii masculi din grupa de reproducere a dietei fără gluten B au fost separați de baraje după lactație la vârsta de trei săptămâni, așa cum este descris pentru animalele femele și împărțiți în trei grupe de testare. Analog cu gruparea șoarecilor femele, unul dintre grupuri a primit dieta de referință (dieta D), un al doilea a primit dieta A care conține grâu, iar un al treilea grup a rămas în dieta B fără grâu (vezi Fig. 4a). Perechi de reproducție Dieta fără gluten, care conține cazeină B Grupuri de testare Dieta B n = 11 Dieta A n = 10 Dieta D n = 12 Fig. 4a Alocarea șoarecilor masculi NOD la grupele de reproducere și de testare din sub-experiment 1a. 28
Material și metode Pentru a separa fracțiunile de proteine conținute în grâu unul de altul, a fost efectuată o extracție modificată în trei etape, prin care albuminele și globulinele erau prezente în supernatant în prima etapă a extracției, prolaminele (gliadinele) erau conținute în supernatant în a doua etapă de extracție și În ultima etapă, gluteninele au fost separate (Wilson și Goulding 1991, Mimouni și colab. 1998, Nicolas și colab. 1998, Idris și colab. 2003). Făină Albumine și Globuline Centrifugare de extracție> 2x Sediment Gliadine Centrifugare de extracție> 3x Gluteline Sediment Extraction (atmosferă N2) Centrifugare> 2x Centrifugare a tuturor supernatanților Depozitare precipitații la 18 C Fig. 7 Schema de extracție a proteinelor și separarea fracțiilor de făină de grâu. S-au cântărit 0,1 g de făină de grâu comercială de tip 550, s-a adăugat 1 ml tampon Sörensen (pH 7,35) și amestecul a fost agitat la 4 ° C timp de 20 minute. După centrifugare (20 min, 1000 rpm, Centrifuga Sorvall RC 5B Superspeed) la 4 ° C, supernatantul a fost îndepărtat și sedimentul a fost extras din nou folosind aceeași metodă după adăugarea tamponului Sorensen. Cei doi supernatanti au fost combinați și depozitați la 4 ° C până la finalizarea etapelor ulterioare de extracție. 33
Materiale și metode Complexele de anticorpi au precipitat. După centrifugare, 60 μl de suprastructură au fost îndepărtate și transferate într-un tub nou. După adăugarea a 10 pl de agaroză IgA anti-umană în 40 pl de tampon TBT în aceste tuburi, a fost incubată din nou la 4 ° C timp de o oră în timp ce se agita. Aceasta a fost urmată de etapele de spălare descrise la punctul 3.2.5 pentru toate tuburile (Proteina-G-Sefaroză și IgA-Agaroză) și măsurarea în contorul γ. nd 3.3 Statistici Evaluarea riscului de diabet cumulat și a frecvențelor diabetului în modelul NOD a fost realizată prin intermediul analizelor de supraviețuire. Testul log-rank a fost utilizat pentru a compara diferitele grupuri din modelul NOD. Comparațiile scorurilor de insulină și prevalența anticorpilor între grupurile din modelul NOD au fost efectuate utilizând testul non-parametric Mann-Whitney U. Corelația dintre legarea relativă a IAA de insulina de pui și afinitățile IAA a fost determinată folosind Corelația Spearman. Afinitățile dintre grupurile individuale au fost comparate folosind testul U Mann-Whitney. În toate analizele, valorile p