Cromatografie

Cromatografie sau. Cromatografie (Greacă, în germană Scrierea colorată) În chimie, se numește un proces care permite separarea unui amestec de substanțe prin distribuirea diferită a componentelor sale individuale între o fază staționară și o fază mobilă. Acest principiu a fost descris pentru prima dată în 1901 de botanistul rus Mikhail S. Tswett, în 1903 a fost descris în public pentru prima dată, iar în 1906 a folosit pentru prima dată termenul de „cromatografie”. El a examinat extracte de plante colorate, de exemplu din materialul frunzelor, și a reușit să izoleze diferiți coloranți din acestea prin cromatografie. Această metodă este utilizată în practică, pe de o parte, în producția pentru izolarea sau purificarea substanțelor (= cromatografie pregătitoare), pe de altă parte, în analiza chimică pentru a separa amestecurile de substanțe în ingrediente cât mai uniforme în scopul identificării sau determinării cantitative. Cromatografia a devenit o parte integrantă a chimiei organice, biochimiei, biotehnologiei, microbiologiei, chimiei alimentelor, chimiei mediului și, de asemenea, a chimiei anorganice.

Alte cunoștințe de specialitate recomandate

Performanță mai mare de cântărire în 6 pași simpli

Care este modalitatea corectă de a verifica repetabilitatea pe scale?

Cum se verifică rapid pipetele?

Cuprins

Descrierea procesului de cromatografie

Cel mai simplu mod de a explica cromatografia este comparându-l:

Un râu furios poate transporta multe resturi. Viteza cu care se deplasează resturile plutitoare depinde de

tipul de resturi plutitoare (granulele de nisip sunt transportate mai repede decât pietricele),
natura albiei râului (suprafețele aspre cresc fricțiunea resturilor plutitoare și reduc astfel viteza de îndepărtare) și
pe viteza de curgere.

În cromatografie, amestecurile de substanțe (= resturi plutitoare) sunt utilizate în așa-numitele Faza mobila (= Apă) pe unul Faza stationara (= Albia râului) transportat pe. Datorită interacțiunilor (a se vedea împărțirea sub principiile de separare) dintre eșantion, faza staționară și faza mobilă, componentele individuale sunt transportate la viteze diferite și pot fi astfel separate una de alta: Un amestec de nisip, pietricele foarte mici și ceva mai mari se formează într-un singur loc adus de râu; după o sută de metri, de exemplu, tot nisipul ajunge primul (întins pe câțiva metri) și după un anumit timp de așteptare toate pietricele mai mici și mult mai târziu cele mai mari, fiecare a despărțit o anumită distanță.

Este mai ușor de înțeles folosind un exemplu: Dacă 45% din moleculele A se află în faza mobilă (în medie), echilibrul dinamic înseamnă că moleculele A individuale sunt, de asemenea, în faza mobilă 45% din timp Faza de cheltuieli (în medie). Prin urmare, viteza lor va fi de 45% din viteza fazei mobile (în medie). Pentru rezultate bune în cromatografie, este crucial ca schimbul de substanțe între cele două faze să aibă loc foarte repede, adică moleculele individuale ale eșantionului să treacă foarte des înainte și înapoi între cele două faze (procese de difuzie, mișcare de căldură). O condiție prealabilă pentru aceasta este că traseele pe care moleculele trebuie să le parcurgă de la faza staționară până la faza mobilă sunt foarte scurte. Dacă faza staționară conține o pulbere, mărimea bobului acestei pulberi ar trebui să fie foarte mică (de exemplu doar câțiva micrometri). Din anumite motive, boabele de pulbere ar trebui, de asemenea, să fie modelate cât mai uniform posibil și să aibă o dimensiune cât mai uniformă (distribuție îngustă a mărimii granulelor).

proces

Pentru cromatografie, este necesară stabilirea fluxului fazei mobile, injectarea probei de separat, separarea efectivă și detectarea. Fluxul fazei mobile se realizează fie prin presiune (pompă hidraulică, presiune gaz), forță capilară, fie prin aplicarea unei tensiuni electrice.

injecţie (= Introducerea amestecului de substanțe în sistemul cromatografic) are loc fie înainte de stabilirea fluxului fazei mobile (de exemplu cromatografia în strat subțire), fie în timp ce faza mobilă curge deja. Cu un număr mare de eșantioane, așa-numitele eșantioane automate sunt utilizate pentru tipuri automatizate de cromatografie (împreună cu propriile sisteme de achiziție de date), care injectează eșantioanele complet automat.

Atunci actualul Separarea amestecului de substanțe pe distanța de izolare. Fără Detectare Cromatografia nu este de conceput (= clarificând momentul în care o substanță trece printr-o anumită parte a sistemului de cromatografie sau când o substanță se oprește după încheierea procesului). Pentru fiecare tip de cromatografie se utilizează diferite sisteme de detectare, fie prin utilizarea proprietăților fizice (absorbția luminii, fluorescență, împrăștiere a luminii, conductivitate termică ...) a substanțelor, fie prin obținerea unui semnal prin reacții chimice. Prin intermediul reacțiilor chimice, de ex. se obține o culoare în cromatografia plană (de exemplu, aminoacizii folosind ninhidrină) sau reacțiile se efectuează înainte de separare (derivatizare precolumnă) sau după separare (derivatizare postcolumnă) în cromatografie pe coloană.

În cromatografia pregătitoare, a Colectoare de facțiuni necesare pentru colectarea substanței separate.

Datorită proiectării, procesele de purificare cromatografică sunt întotdeauna procese discontinue. Aceasta înseamnă că numai o anumită cantitate de substanță poate fi aplicată și separată înainte de a continua cu următoarea cantitate. Acest lucru este deosebit de problematic atunci când se prelucrează cantități mari, astfel încât au fost dezvoltate unele procese pentru a putea opera cromatografia continuă: cromatografia inelară, cromatografia TMB (True Moving Bed) și SMB (patul mobil simulat).

Definiția unor termeni

Faza stationara

Fază care interacționează cu substanțele individuale ale amestecului de substanțe și nu se mișcă. Rămânerea analiților în timpul reținerii lor alternează între faza mobilă și cea staționară (mers aleatoriu) și determină timpul de retenție caracteristic substanței.

Faza mobila

Faza în care amestecul de substanțe este introdus la începutul sistemului de separare și care este mutat (fază pe o substanță solidă sau lichidă). Fazele mobile diferă în ceea ce privește capacitatea lor de eluare („Forța” vezi mai jos „Intervalul Elutrope”), aceasta necesită timpi de retenție diferiți și deseori selectivități diferite.

Retenţie

Întârzierea substanțelor individuale ale amestecului de substanțe prin interacțiunea cu faza staționară.

Timp de retenție

Timpul în care moleculele unei substanțe pure trebuie să migreze prin coloană (de la injecție la detectare).

Timp de curgere (timp mort)

Timpul de curgere (anterior și „timpul mort”) indică timpul în care faza mobilă sau o substanță care nu este reținută trebuie să migreze prin coloană. O substanță care nu este reținută (Substanță inertă) este doar într-o concentrație neglijabil de mică în faza staționară și, prin urmare, trece prin coloană în același timp cu faza mobilă.

Eluție

Elution (din lat. eluați „Spălare”) este levigarea sau deplasarea substanțelor adsorbite din adsorbanți solizi sau lichizi și schimbători de ioni prin adăugarea continuă a unui solvent (Eluent = faza mobilă). Soluția care curge din coloana de separare devine Eluate numit.

Acest proces are o importanță deosebită în extracția în fază solidă.

Eluent

Faza mobilă care a depășit distanța de izolare.

Seria eluotropă

Dispunerea solvenților folosiți în mod obișnuit ca faze mobile în funcție de puterea lor de eluare cu o substanță de referință (de obicei silicagel sau oxid de aluminiu). Ordinea poate fi selectată în ordine crescătoare sau descendentă.

Cromatografie

Coloană: În cromatografie, o coloană este un tub gol cu un diametru de câțiva micrometri până la câțiva metri. Acest tub este fie complet umplut cu faza staționară (coloană ambalată), fie acoperit subțire pe interior (coloană capilară).

Mecanism de fază inversată

Există două modalități de separare a unui amestec de substanțe în cromatografia de adsorbție:

Faza normală: fază polară staționară (cum ar fi silicagel, oxid de aluminiu), fază mobilă nepolară până la polară medie (cum ar fi substanțe HC, dioxan, acetat de etil.) sau
Faza inversată (Faza inversată): faza staționară nepolară (cum ar fi silicagel modificat) și faza mobilă polară (cum ar fi apa tamponată).

În primul caz, substanțele lipofile sunt ușor eluate, substanțele polare sunt dificile, în caz invers substanțele polare sunt ușor eluate („similia similibus solvuntur”).

În HPLC, este adesea utilizată eluția în gradient (fază inversă), în care compoziția solventului este modificată încet (de exemplu, de la 80% la 20% conținut de apă). Alcanii ies din coloană foarte târziu și aminoacizii apar foarte devreme și aceste fracțiuni pot fi tăiate.

Metodele de separare cromatografică pot fi clasificate în funcție de diferite aspecte:

Clasificare conform principiului separării

Principiul fundamental al tuturor proceselor cromatografice este stabilirea deseori repetată a unui echilibru între o fază staționară și o fază în mișcare. Echilibrul se poate dezvolta datorită diverselor efecte fizico-chimice.

Clasificare în funcție de fazele utilizate

Datorită fazelor mobile, cromatografia poate fi împărțită în trei zone, care pot fi împărțite în grupuri diferite în funcție de purtătorii fazelor staționare sau de starea fizică a fazelor staționare.

Parametri de cromatografie

Lungimea coloanei L.

Timp de curgeret0

Timp de retențietR.

tu se numește liniar Debit faza mobilă prin coloană, este definită ca:

Factorul de retențiek este definit de

Factorul de separare α indică calitatea separării a două substanțe. Se bazează pe timpii de păstrare tR. a componentelor din coloană. Timpul de păstrare este timpul de care componentul în cauză are nevoie pentru a traversa coloana și este afișat la maximul maxim:

R., rezoluție cromatografică (rezoluţie) din două vârfuri se calculează din:

, Numărul de etape de separare sau Numărul tăvilor descrie numărul setărilor de echilibru ale substanței care trebuie separată între faza staționară și cea mobilă din coloană. Cu cât este mai mare N, cu atât mai multe ajustări de echilibru pot fi făcute într-o anumită lungime, ceea ce duce la o performanță mai bună de separare a coloanei. N se calculează folosind formula:

B.: Lățimea liniei de bază

F.W.HM.: "Lățime completă la jumătate maximă" Fwhm

: Capacitate de vârf; Indică câte vârfuri într-un interval dintre t0 și valoarea k a unui anumit vârf pot fi teoretic separate unele de altele cu o rezoluție de R = 1.

H denotă Înălțimea pasului de separare (sau înălțimea teoretică a podelei) a unei tăvi teoretice (HETP) și este relația dintre lungimea coloanelor și numărul tăvilor:

Valorile practice sunt cuprinse între 0,1 și 0,5 mm.

Înălțimea partiției H

Înălțimea etapei de separare a unei coloane cromatografice este o măsură a eficienței de separare a coloanei. Etapa de separare poate fi imaginată ca secțiunea coloanei de separare pe care se stabilește odată echilibrul cromatografic. Cu cât astfel de setări de echilibru „au spațiu pe coloană”, cu atât este mai mică înălțimea etapei de separare și cu atât este mai mare eficiența de separare a coloanei. Pentru a realiza o separare mică, înălțimea treptelor sunt sub analitice condiții sunt necesare următoarele cerințe:

Se așteaptă un echilibru rapid de adsorbție sau distribuție. Prin urmare, diametrul particulelor ar trebui să fie cât mai mic posibil.
Temperatura constantă pe toată coloana. Pentru aceasta poate fi utilizat un termostat pe coloană.
Debit constant: Pentru aceasta se folosește o pompă cu piston cu până la 400 bari.
Intervalul de adsorbție liniară: faza staționară nu trebuie supraîncărcată pe parcursul cromatografiei.
Difuzarea neglijabilă ar fi de dorit, dar din păcate nu poate fi realizată experimental. Prin urmare, se utilizează ambalaje cât mai regulate cu particule cu diametru deosebit de mic.

Așa-numita ecuație Van Deemter pentru HPLC poate fi utilizată pentru a determina înălțimea etapei de separare în funcție de debitul eluantului:

H înălțimea treptei de separare,
tuX este debitul liniar.
A. -termen ia în considerare difuzia turbionară care apare din diferite căi de curgere prin ambalare. Se aplică următoarele: unde
- factorul de ambalare,
- d denotă diametrul particulelor.
B. -termen ia în calcul difuzia longitudinală. Difuzia longitudinală este difuzia moleculelor de analit în ambele direcții ale etapei de separare. Se aplică următoarele: unde:
- D. constanta de difuzie în faza mobilă și
- L. este factorul labirint. Factorul labirint ia în considerare structura porilor fazei staționare.
C. -termen ia în considerare extinderea vârfului datorită stabilirii lente a echilibrului între faza mobilă și cea staționară. Iată și constanta de difuzie D. de observat de-a lungul porilor fazei staționare. Se aplică

Simetrie de vârf

Teoretic, fiecare substanță ar trebui să părăsească o coloană de cromatografie ca o linie de eluare ascuțită. Cu toate acestea, din diverse motive, vârfurile cromatografice au întotdeauna o anumită lățime. În mod ideal, au forma unei curbe de clopot gaussiene. În practică, însă, se întâmplă adesea ca vârfurile să se abată de la această formă ideală și să pară mai mult sau mai puțin asimetrice. O asimetrie în care creșterea frontală a vârfului este mai abruptă decât căderea vârfului este cunoscută sub numele de „coadă”, în timp ce efectul că creșterea este mai puțin abruptă decât căderea este cunoscut sub numele de „față”. Factorul de coadă, care este o măsură a simetriei vârfului, este determinat prin scăderea perpendicularului de la vârful maxim la linia de bază și la o anumită înălțime, de obicei 10% din înălțimea vârfului, distanțele până la vârful frontului (a) și până la vârful vârfului (b ) determinat. Apoi se formează coeficientul celor două valori, prin care sunt utilizate diferite formule de calcul (de exemplu, conform IUPAC sau USP):

Un „vârf gaussian” ideal atinge valoarea 1, valorile peste 1 înseamnă „coadă”, valorile sub 1 înseamnă „front”.

Experiment practic

Cromatografia poate fi efectuată acasă folosind mijloacele disponibile în comerț. Ai nevoie:

un sac de filtrare, dacă este posibil alb sau negru
unele creioane colorate din soiul solubil în apă și cu siguranță pixuri care nu sunt solubile în apă.

Vopseaua se aplică pe marginea inferioară a filtrului de cafea și hârtia este așezată într-un castron cu apă, astfel încât hârtia să se înmoaie cu apă.

Deoarece culoarea creioanelor este solubilă în apă, apa transportă acum culoarea în sus.

De exemplu. Creionul roșu nu este practic roșu, ci constă dintr-un amestec de culori diferite care împreună apar roșu. În experiment, diferiții pigmenți de culoare interacționează cu hârtia în grade diferite și sunt astfel transportați mai mult sau mai puțin rapid de apă.

Ca rezultat, puteți vedea în curând mai multe pete colorate diferite, culorile creionului sunt separate prin cromatografie.

Pentru a testa dependența separării de solvent, se poate efectua din nou acest experiment cu același stilou cu vodcă, curățând benzină sau alcool denaturat și observând rezultatele diferite. (Cu toate acestea, acest lucru trebuie făcut numai în încăperi bine ventilate, deoarece fumurile din combustibilul de curățare sunt toxice.)