Cuantificarea aterosclerozei în protocolul șoarecilor (tradus în germană)

rezumat

Modelele murine de ateroscleroză sunt instrumente utile pentru studierea căilor patogene la nivel molecular, dar necesită cuantificarea standardizată a dezvoltării leziunilor. Acest protocol descrie o metodă optimizată pentru determinarea dimensiunii leziunii în arterele majore, inclusiv rădăcina aortică, arcada aortică și artera brahiocefalică.

Abstract

Bolile cardiovasculare sunt principala cauză de deces în lume. În majoritatea cazurilor, cauza principală este arterioscleroza, care este în parte o boală inflamatorie cronică. Studiile experimentale de ateroscleroză au elucidat rolul colesterolului și al inflamației în procesul bolii. Acest lucru a condus la studii clinice de succes cu ingrediente farmaceutice active care reduc manifestările clinice ale aterosclerozei. Experimente atent și bine controlate pe modele de șoareci ale bolii ar putea elucida și mai mult patogeneza bolii, care nu este pe deplin înțeleasă. O analiză standardizată a leziunilor este importantă pentru a reduce variabilitatea experimentală și pentru a crește reproductibilitatea. Determinarea dimensiunii leziunii în rădăcina aortică, arcada aortică și artera brahiocefalică sunt obiective obișnuite în ateroscleroza experimentală. Acest protocol oferă o descriere tehnică pentru evaluarea aterosclerozei la toate aceste site-uri la un singur mouse. Protocolul este deosebit de util atunci când materialul este limitat, așa cum se întâmplă adesea la caracterizarea animalelor modificate genetic.

Introducere

Boala cardiovasculară este principala cauză de deces în lume, cu boli cardiace ischemice și accident vascular cerebral, reprezentând unul din patru decese 1. Majoritatea cazurilor sunt cauzate de ateroscleroză, o boală caracterizată prin acumularea lentă a plăcilor care conțin lipide cu semne de inflamație cronică în arterele mari și mijlocii 2. Boala trece de obicei neobservată timp de câteva decenii până când o ruptură sau eroziune a plăcii provoacă tromboză arterială, ceea ce duce la afectarea țesutului ischemic.

O arteră normală constă dintr-un strat intim cu celule endoteliale și celule musculare netede distribuite slab, un strat media cu celule musculare netede și lamele elastice și un strat adventitial înconjurător cu țesut conjunctiv slab 3. Retenția intimă a LDL compensează dezvoltarea aterosclerozei 4. Acumularea și modificarea lipoproteinelor duc la agregare și prindere în interiorul arterelor 5. O reacție inflamatorie este cauzată de lipoproteinele capturate și modificate 6. Celulele endoteliale încep să exprime molecule de aderență, cum ar fi VCAM-1, în locurile din arborele arterial cu flux de sânge turbulent, ducând la recrutarea monocitelor circulante și a altor leucocite 7. Monocitele infiltrante se diferențiază în macrofage, care înghițesc lipidele cu conversia ulterioară în celule de spumă macrofagă 8 .

Ateroscleroza a fost studiată la modelele de șoareci cu o frecvență crescândă de la mijlocul anilor 1980. C57BL/6 este cea mai frecvent utilizată tulpină de șoarece consangvinizat pentru aceste studii și este utilizată ca fundal genetic pentru majoritatea celor 9 tulpini modificate genetic. Această tulpină a fost fondată în anii 1920 10, iar genomul său a fost publicat în 2002 11. Experimentele la modelele de șoareci au mai multe avantaje: coloniile se înmulțesc rapid, carcasa economisește spațiu, iar consangvinizarea reduce variabilitatea experimentală. Modelul permite, de asemenea, manipulări genetice, cum ar fi ștergerea genei vizate și inserarea transgenelor. Acest lucru a condus la o nouă înțelegere fiziopatologică a bolii și la noi obiective terapeutice 12.

Șoarecii C57BL/6 de tip sălbatic sunt rezistenți în mod natural la arterioscleroză. Ei au cea mai mare parte a colesterolului circulant în HDL, iar leziunile aterosclerotice complexe nu se formează chiar și atunci când sunt hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi și bogată în colesterol 13. Șoarecii hipercolesterolemici, cum ar fi Apoe -/- pe fundalul C57BL/6, sunt, prin urmare, folosiți ca modele experimentale de arterioscleroză 14, 15. Lipsa ApoE afectează absorbția ficatului de lipoproteine reziduale și perturbă grav metabolismul grăsimilor. La șoareci apoe -/-, colesterolul circulant circulă în principal în particule VLDL, iar șoarecii dezvoltă plăci aterosclerotice complexe pe o dietă regulată Chow.

Șoarecii Ldlr -/- imită dezvoltarea arteriosclerozei la om cu hipercolesterolemie familială 16. Șoarecii Ldlr -/- au nevoie de o dietă occidentală pentru a dezvolta un fel de fel 17. Dietele occidentale imită consumul uman și conțin de obicei 0,15% colesterol. Receptorul LDL recunoaște ApoB100 și ApoE și mediază absorbția particulelor LDL prin endocitoză. Receptorii LDL sunt fundamentali pentru eliminarea hepatică a LDL din circulație, în timp ce expresia receptorului LDL în celulele hematopoietice nu afectează acest proces. Acest lucru deschide posibilitatea unui transplant de măduvă osoasă a celulelor Ldlr +/+ în receptorul hipercolesterolului Ldlr -/- și evaluarea dezvoltării arteriosclerozei. Chimerele măduvei osoase au fost utilizate pe scară largă pentru a studia implicarea celulelor hematopoietice în ateroscleroza experimentală. Cu toate acestea, transplantul de măduvă osoasă ar putea afecta dimensiunea și compoziția plăcilor aterosclerotice, făcând interpretarea rezultatelor ambiguă.

S-au dezvoltat diferite variante de șoareci Apoe -/- și Ldlr -/- cu modificări genetice suplimentare pentru a studia procesele specifice bolii 18. Un exemplu sunt șoarecii umani APOB100-transgenici Ldlr -/- (HuBL) care poartă întreaga genă umană APOB100 19, 20. Acești șoareci dezvoltă hipercolesterolemie și ateroscleroză pe o dietă regulată. Cu toate acestea, dezvoltarea plăcilor aterosclerotice complexe durează cel puțin șase luni, iar protocoalele experimentale mai scurte utilizează de obicei diete occidentale 21. O mare parte din colesterolul plasmatic circulă în particule LDL, ceea ce conferă șoarecilor HuBL un profil lipoproteic dislipidemic mai uman comparativ cu șoarecii Apoe -/- și Ldlr -/-. Șoarecii HuBL permit, de asemenea, studii asupra ApoB uman ca autoantigen 22 .

Modelele de ateroscleroză la șoareci dezvoltă plăci aterosclerotice complexe cu caracteristici comune ale bolilor umane. Cu toate acestea, plăcile sunt destul de rezistente la rupere cu infarct miocardic ulterior. Aterotromboza este dovedită doar sporadic și provocatoare din punct de vedere experimental pentru a evalua 23, 24, 25. Au fost dezvoltate modele speciale de spargere a plăcii, dar câmpul de încercare nu are un model fiabil și reproductibil pentru evaluarea stabilizatorilor plăcii.

Cuantificarea aterosclerozei a fost raportată în mai multe moduri în literatura de specialitate. Eforturile recente au încercat să standardizeze proiectarea experimentală, desfășurarea și raportarea studiilor pe animale 26. Anchetatorii au diferite preferințe și tehnici adaptate laboratoarelor lor. Majoritatea proiectelor de cercetare sunt, de asemenea, unice într-un mod în care necesită unele modificări de protocol. Datorită naturii multifactoriale a bolii, controalele optime vor varia de la proiect la proiect. Condițiile locale și lipsa standardizării pot duce la diferențe observate în dezvoltarea bolii, ceea ce împiedică progresul zonei de cercetare. Diferențele în variabilitatea experimentală înseamnă, de asemenea, că calculele statistice ale performanței trebuie să se bazeze pe studii pilot în condiții locale.

Cuantificarea arteriosclerozei este recomandată în mai multe locuri din arborele vascular. Acest protocol descrie cum se obțin rezultate din rădăcina aortică, arcada aortică și artera brahiocefalică la un singur șoarece, în plus față de lăsarea restului aortei toracoabdominale pentru alte analize. Preparatele în față permit cuantificarea rapidă a plăcilor încărcate cu lipide în arcada aortică. Sarcina bolii în artera brahiocefalică poate fi de asemenea cuantificată atunci când probele sunt atent vizualizate. Secțiunea transversală mai lungă a rădăcinii aortice lasă mai multe secțiuni disponibile pentru o evaluare detaliată a compoziției plăcii.

Protocol

Toate experimentele pe animale necesită aprobarea autorităților etice.

1. Sacrificiul șoarecilor și microdisecția aortică

Figura 1: Inima și arcada aortică in situ. (A.) Plămânii, traheea, esofagul și timusul sunt îndepărtați pentru a afișa arcada aortică in situ într-o femelă de șapte săptămâni apoe -/- șoarecă pe dietă regulată chow într-o micrografie, bară de scară = 2 mm. Liniile punctate indică unde se taie arcul aortic și ramurile acestuia. (B.) O reprezentare schematică a inimii și aortei. Linia punctată în roșu indică locul în care ar trebui tăiată inima înainte ca rădăcina aortică să fie criomontată. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

2. Analiza în față a arterei aortice și a arterei brahiocefalice

Figura 2: Cuantificarea leziunilor aterosclerotice. (A.) Arcul aortic de la un bărbat uman în vârstă de 20 de săptămâni, APOB100-transgenic Ldlr -/- (HuBL) hrănit cu dieta occidentală timp de zece săptămâni fixat deschis și colorat cu Sudan IV pentru plăci bogate în lipide. Întreaga zonă a arcului aortic este conturată cu linia punctată în alb în micrografie, bară de scară = 2 mm. Liniile punctate în galben conturează aria totală a arterei brahiocefalice. (B.) Secțiunea transversală a rădăcinii aortice la 400 m de sinusul aortic la un bărbat în vârstă de 20 de săptămâni Ldlr -/- alimentat cu șoareci dieta occidentală timp de opt săptămâni vizualizat într-o micrografie, bară la scară = 500 m. Liniile punctate în negru conturează întreaga zonă a vasului și leziunile aterosclerotice colorate cu roșu ulei O și localizate în intima arterială. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

3. Criosecția rădăcinii aortice

Figura 3: Organizarea diapozitivelor pentru secțiuni seriale ale rădăcinii aortice. În timpul criosecției rădăcinii aortice, trebuie colectată fiecare secțiune de 10 m grosime care se întinde pe primii 800 m de aortă ascendentă. Este necesară organizarea sistematică a diapozitivelor pentru a obține secțiuni adecvate pentru diferite utilizări. Analiza compoziției leziunii include de obicei colorarea cu ulei roșu O pentru lipide și colorarea cu roșu Picrosirius pentru colagen. Secțiunile rămase sunt colectate și fixate cu acetonă pentru imunohistochimie și colorare imunofluorescentă. Această cifră a fost modificată de la Gistera și colab 30. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

4. Colorarea cu ulei roșu O și cuantificarea aterosclerozei în rădăcinile aortice

Rezultate reprezentative

Oil Red O este un colorant disazo solubil în grăsimi, roșu aprins, care colorează lipidele neutre. Lipidele polare din membranele celulare nu sunt colorate. Colorarea cu roșu ulei poate fi efectuată pe eșantioane proaspete, congelate sau fixate în formalină, dar nu și pe eșantioane încorporate în parafină datorită îndepărtării lipidelor în procesul de depilare necesar. O cuantificare a acumulării lipidice lezionale ar putea fi realizată prin umflarea culorii zonei O-pozitiv roșu-ulei a întregii zone a leziunii (Figura 4C). Hematoxilina produce o pată albastră pe nucleele celulare care este utilă în vizualizarea morfologiei plăcii. Arterele coronare dreapta și stânga se abat în general de la aortă cu 250 m de sinusul aortic 27, care deseori coincid cu cele mai proeminente dimensiuni ale leziunii. Secțiunile transversale din această regiune sunt adesea prezentate ca rezultate reprezentative (Figura 4D).

Uleiul roșu O ar putea fi utilizat pentru colorarea aortelor preparate pe față, dar acest protocol folosește Sudan IV, un alt colorant disazo convenabil solubil în grăsimi. Sudan IV vizualizează clar plăcile aterosclerotice în culoarea roșu portocaliu prin colorarea lipidelor, trigliceridelor și lipoproteinelor. Eliminarea fundalului întunecat în imagini reprezentative ale arcurilor aortice en face ar putea îmbunătăți reprezentarea vizuală (Figura 5A). De obicei, dimensiunea leziunii este împărțită în grupuri, ceea ce permite testarea statistică cu testul t al elevului între grupuri. Un grafic de împrăștiere care arată atât șoarecii individuali, cât și media comparată între grupuri este un mod informativ de a vizualiza rezultatele (Figura 5B-C). Deoarece variația în cadrul grupurilor este de obicei diferită între pozițiile din arborele vascular, sunt de obicei necesare calcule separate ale performanței. Abaterile inutile pot fi evitate prin competența metodică și standardizarea protocolului. Obținerea de rezultate semnificative statistic este importantă, dar trebuie luată întotdeauna în considerare relevanța biologică pentru o diferență observată.

Figura 5: Leziuni aterosclerotice în arcul aortic și artera brahiocefalică. (A.) Microscoape reprezentative ale arcurilor aortice cu plăci care conțin lipide colorate cu Sudan IV (în culoarea portocalie) de la șoareci vechi de 20 de săptămâni alimentați cu dieta occidentală timp de zece săptămâni, vizualizați împreună. Bară de scară = 2 mm. Șoareci umani APOB100-Ldlr -/- (HuBL) transgenici au fost folosiți ca martori și grupul experimental a constat din șoareci transgenici TCR cu celule T reactive LDL (BT1) încrucișate pentru a forma șoareci HuBL. (B.) Leziuni aterosclerotice în arcada aortică (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12; test Schüler t). (C.) Leziuni aterosclerotice în artera brahiocefalică (HuBL n = 8, BT1xHuBL n = 9, test t Student). (B.-C.) Punctele reprezintă șoareci individuali, barele indică valoarea medie "SEM. * P - 0,05". Această cifră a fost preluată de la Gistera și colab. 32 schimbat. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 1 suplimentară: Organizarea alternativă a diapozitivelor pentru secțiuni seriale ale rădăcinii aortice. O organizare sistematică simplă a culiselor pentru colectarea secțiunilor din rădăcina aortică. Colecția permite colorarea cu ulei roșu O pentru lipide și imunohistochimie sau imunofluorescență. Diapozitivele speciale pentru colorarea roșie a colagenului Picrosirius sunt omise. Vă rugăm să faceți clic aici pentru a descărca acest fișier.

Discuţie

Dezvăluiri

Autorii nu au nimic de dezvăluit.

Mulțumiri

Mulțumim tuturor foștilor membri ai Unității de cercetare cardiovasculară experimentală a lui Göran K Hansson care au contribuit la dezvoltarea acestui protocol în ultimul sfert de secol. Suntem deosebit de recunoscători pentru contribuțiile lui Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson și Inger Bodin. Această lucrare a fost susținută de subvențiile proiectului 06816 și sprijinul Linnaeus 349-2007-8703 de la Consiliul Suedez de Cercetare și subvenții de la Fundația Suedeză pentru Inimă și Plămân, Consiliul Județean Stockholm, Fundația Profesor Nanna Svartz, Loo și Hans Osterman. Fundația pentru Cercetare Medicală, Fundația de Cercetare a Karolinska Institutet și Fundația pentru Bolile Geriatrice la Institutul Karolinska.