De la Clinica Medicală și Policlinica II - Großhadern
De la Clinica Medicală și Policlinica II - Großhadern a Ludwig-Maximilians-Universität München Komm. Director: Prof. Dr. med. Efectul A. L. Gerbes al reducerii puternice a greutății (dieta vs stomacul mânecii) asupra inflamației și metabolismului glucozei la pacienții obezi cu diabet zaharat de tip 2 Disertație pentru obținerea diplomei de doctor în medicină la Facultatea de Medicină a Universității Ludwig Maximilians din München prezentată de Katrin Widynski din München 2015
Cu aprobarea Facultății de Medicină a Universității din München Raportor: Prof. Dr. med. Klaus G. Parhofer Coraportor: Priv. Doza. Dr. Maximilian Bielohuby Prof. Dr. Christine Meisinger Co-supraveghere de către angajatul dr.: Dr. med. Benedikt Aulinger Dean: Prof. Dr. med. adâncitură. Reinhard Hickel Ziua examenului oral: 19 noiembrie 2015
Declarația pe proprie declarație, în locul unui jurământ, că am scris această disertație cu privire la efectul reducerii puternice a greutății (dieta vs stomacul mânecii) asupra inflamației și metabolismului glucozei la pacienții obezi cu diabet de tip 2, că nu am folosit alte ajutoare decât cele specificate și că am făcut toate constatările care au fost preluate integral sau aproximativ din literatura de specialitate, marcate ca atare și identificate individual în funcție de originea lor prin denumirea sursei. De asemenea, declar că disertația prezentată aici nu a fost depusă în aceeași formă sau într-o formă similară altei instituții în scopul obținerii unei diplome academice. Locul, data Semnătura doctorandului
Cuprins O Introducere. 1 I Obezitate, diabet și ateroscleroză. 1 inflamație II. 1 III Peptide importante în geneza diabetului și aterosclerozei. 4 IV Opțiuni terapeutice. 8 1 Opțiuni de tratament conservator. 8 2 Opțiuni de tratament chirurgical. 8 2.1 Proceduri restrictive. 9 2.2 Proceduri restrictive cu componente malabsorptive. 9 2.3 Proceduri malabsorbtoare cu o componentă restrictivă. 9 V Probleme și obiective. 11 B Material și metode. 12 I material. 12 II metode. 17 1 Partea clinico-experimentală. 17 1.1 Proiectarea studiului și participanții. 17 1.2 Procedură și vizite. 18 1.3 Chirurgia stomacului mânecii și dieta. 19 1.3.1 Grup gastric cu manșon. 19 1.3.2 Grupa de dietă. 20 1.4 Clemă hiperglicemică și hiperinsulinemică - euglicemică. 20 1.4.1 Clemă hiperglicemică. 21 1.4.2 Hiperinsulinemic - clemă euglicemică cu biopsie de țesut adipos. 22 A doua parte a experimentului de laborator. 23 2.1 Elisa și metoda de măsurare fotometrică. 23 2.2 Reacția în lanț a polimerazei. 23 2.2.1 Extracția ARN, inclusiv digestia DNazei. 23 2.2.2 Transcriere inversă - PCR (RT - PCR). 24 2.2.3 PCR calitativă. 25 2.2.4 PCR cantitativă în timp real (qrt-PCR). 26 I.
3 histologie. 28 4 evaluarea statistică a rezultatelor. 28 C rezultate. 29 I Date de bază ale participanților la studiu. 29 II Aprovizionarea cu energie și compoziția alimentelor. 30 III Dezvoltarea IMC și modificarea circumferinței taliei. 32 Modificarea IV a glicemiei în post, a HbA1c și a medicamentelor. 33 V Evaluarea clemelor ca bază pentru determinarea rezistenței la insulină. 36 VI Modificarea sensibilității la insulină. 37 VII Modificarea parametrilor inflamației. 40 VIII Analiza histologică a țesutului adipos. 51 D Discuție. 53 I Consumul de energie și pierderea în greutate. 53 II Îmbunătățirea metabolismului glucozei. 54 III Modificarea inflamației. 56 IV Schimbare în NT-ProBNP. 59 V Explicații alternative pentru îmbunătățirea metabolismului glucozei. 60 VI Limitările studiului. 61 E rezumat. 63 F Lista abrevierilor. 68 G Lista figurilor. 70 H Lista tabelelor. 72 I Bibliografie. 73 J Mulțumiri. 83 II
O componentă restrictivă redusă, care este utilizată în principal la pacienții cu un IMC> 50 kg/m 2 (1, 75). Pentru toate procedurile laparoscopice descrise, mortalitatea perioperatorie este mai mică de 1%, iar alegerea intervenției depinde de mai mulți factori (de exemplu, IMC, vârstă, comorbidități) (1). Ceea ce toate procedurile au în comun este importanța îngrijirii postoperatorii strânse pentru a asigura pierderea permanentă în greutate și pentru a preveni simptomele de carență (1, 75). Fig. 2a: Bandă gastrică, preluată din (1) Fig. 2b: Manșon stomac, preluată din (1) Fig. 3a: Bypass gastric Roux-en-Y, preluat din (1) Fig. 3b: Diversiune biliopancreatică cu comutator duodenal, Fig. din (1) 10
Tampon de încărcare ADN 6x 10mM Tris (ph 7,6), 0,03% (g/v) albastru de bromofenol, 0,03% (g/v) xilen cianol, 60% (v/v) glicerină, 60 mm EDTA PBS 10 x ( pH 7,4) 1,37 M NaCl, 26,8 mm KCl, 81 mm Na 2 HPO 4, PBS 1x (ph 7.4) diluant reactiv (ph 7.4) TAE 1x TAE 50x gel gel de agaroză (1 %) 14,7 mm KH 2 PO 4 10% (v/v) PBS (10x) 10% (v/v) PBS (10%), 1% (g/v) BSA 2% (v/v) TAE (50x) 2 M Tris, 1 M acid acetic glacial, 0,05 M EDTA agaroză LE în TAE 1x, kituri de bromură de etidiu Pentru kiturile utilizate, soluțiile și tampoanele furnizate au fost utilizate conform protocolului producătorului. Set RNase-Free DNase Qiagen, Hilden, Germania RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germania SuperScript III Sistem de sinteză First-Strand Invitrogen, Karlsruhe, Germania Enzimă La utilizarea enzimelor, s-au utilizat soluțiile și tampoanele recomandate și furnizate de producător. AmliTaq Gold DNA Polymerase Applied Biosystems, Carlsbad, SUA (5U/µl) Deoxiribonuclează I, Amplificare Invitrogen, Karlsruhe, Germania Grad (1U/µl) Taq ADN polimerază, Invitrogen recombinant, Karlsruhe, Germania (5 U/µl) primer PCR (5 U/µl) Eurofins MWG Operon, Ebersberg) Primer sequence (5-3) GAPDH (hm) forward agggctgcttttaactctggt GAPDH (hm) reverse ccccacttgattttggaggga 13
TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, Carlsbad, SUA) Secvența de referință a genei țintă (umane) Număr de comandă TNF alfa NM_000594.2 Hs00174128_m1 MCP-1 NM_002982.3 Hs00234140_m1 IL-6 NM_000600.3 Hs00985639_m1 NM1 FN1 Fibronectin NM_002026.2 Hs00365052_m1 Adiponectin NM_001177800.1 Hs00605917_m1 RBP4 NM_006744.3 Hs00198830_m1 Vaspin (Serpina12) NM_173850.2 Hs005451801_m1 Număr de referință măsurată în chimie clinică la spital. Kituri Elisa pentru probe de plasmă umană au fost întotdeauna utilizate. Parametru Producător Număr de comandă TNF-a R&D cu ultrasunete Quantikine KHC3014 Leptină R&D Quantikine DLE00 MCP-1/CCL2 R&D Quantikine DCP00 Adiponectin R&D Quantikine DRP300 Resistin R&D Quantikine DRSN00 Fibronectin Abcam AB1088948 NT-ProBNP Quantine RDIN4150 R&D Quantikine HS600B 14
2.2.2 Transcriere inversă - PCR (RT - PCR) Deoarece ARN-ul nu poate funcționa ca un șablon pentru ADN polimeraza, trebuie mai întâi să fie transcris în cdna (copia ADN) (transcriere inversă). Acest lucru a fost realizat folosind sistemul de sinteză First-Strand SuperScript III pentru RT-PCR de la producătorul Invitrogen. Transcrierea inversă a fost combinată cu un PCR pentru a amplifica cdna. Abordarea 1 a fost utilizată pentru denaturarea ARN și este prezentată în Tabelul 2. Deoarece concentrația de ARN izolat din grăsimea biopsiei a fost foarte scăzută, 8 pl au corespuns cantității maxime de ARN disponibile. După incubare timp de 5 minute la 65 ° C și răcire timp de 1 minut pe gheață, a fost adăugat al doilea lot, ale cărui componente sunt enumerate în Tabelul 3. Programul RHRT PCR a fost apoi pornit așa cum este indicat în Tabelul 4. Tabelul 2: Amestec de reacție (simplu) pentru denaturarea ARN Probă de ARN digerat de DNază 8 µl Primer aleatoriu hexameric 1 µl dntp s (10 mm) 1 µl 10 µl Tabelul 3: Amestec de reacție (simplu) pentru amestec de sinteză ADNc 10 x RT Buffer 2 µl MgCl 2 (25mM) 4 µl DTT (0,1 M) 2 µl RNaseOUT 1 µl SuperScript III RT 0,5 µl apă tratată cu DEPC 0,5 µl 10 µl 24
Tabelul 4: Programul PCR de transcriere inversă în termociclorul PCR Durata temperaturii Etapa 25 C 10 min. Recocire 50 C 50 min. Sinteza Cdna 85 C 5 min. Terminare 4 C final 2.2.3 PCR calitativ Pentru a dovedi o transcriere reușită a DNazei digerate A fost efectuată o PCR calitativă pentru ARN în ADNc. Ca referință a fost specificată GAPDH umană (gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază). S-au utilizat ADN polimeraza Taq (recombinantă, 5U/μl) de la Invitrogen și reactivii conținuți în trusă (Tab. 5). Programul PCR a fost realizat în PXE 0.2 Thermal Cycler (Thermo Electron Corporation) și poate fi găsit în Tabelul 6. Tab. 5: Lot de reacție (simplu) pentru PCR standard (control GAPDH) 10x tampon PCR 2 µl amestec dntp (10mM) 0,4 µl MgCl 2 (50mM) 0,6 µl primer pentru 1 µl primer rev 1 µl șablon cdna 1 µl Taq ADN polimerază (5U/µl) 0,2 µl ddh 2 O 14 µl 20 µl 25