Descoperirea topografiei circuitelor neuronale în protocol multicolor (tradus în franceză)
rezumat
Oferim un ghid practic pentru livrarea in vivo a urmăritorilor și utilizarea căii spinocerebeloase ca sistem model pentru a demonstra pașii esențiali pentru analiza cu succes a circuitului neuronal la șoareci. Descriem în detaliu protocolul nostru de urmărire versatil care exploatează aglutinina germenilor de grâu (WGA) conjugată cu fluorofori Alexa.
Abstract
Protocol
1. Oferiți urmăritori in vivo folosind o intervenție chirurgicală sterilă (secțiunile 01.01 - 01.16)
Pe tot parcursul procedurii, vă sfătuim să se utilizeze tehnici chirurgicale sterile standard. Aceasta include utilizarea mănușilor sterile, a unei halate și a unei măști de față. Instrumentele trebuie fie autoclavizate înainte de utilizare, fie curățate cu apă și apoi cu etanol. În timpul intervenției chirurgicale și în special între animale, fragmentele de țesut curăță instrumentele și sterilizează instrumentele cu un sterilizator cu bile fierbinți (Steri 250 Cat. # 18000-45, Fine Science Tools). În plus, este esențial să vă organizați spațiul de lucru astfel încât să aveți zone desemnate pentru pregătirea animalelor (bărbierit etc.), chirurgie și o zonă de recuperare în care animalul să poată fi ușor verificat, încălzit și prevăzut cu analgezice, după cum este necesar. Cheia supraviețuirii intervențiilor chirurgicale de succes este reducerea riscului de infecție și menținerea unei strategii agresive de îngrijire postoperatorie. Vă rugăm să consultați tabelul unde puteți găsi toate echipamentele și reactivii necesari pentru acest protocol.
2. Detectarea fibrelor mușchite trasate anterograd
4. Microscopie și analiză de date
Toate studiile pe animale au fost efectuate în conformitate cu un protocol IACUC pe animale aprobat în conformitate cu orientările instituționale de la Colegiul de Medicină Albert Einstein. Șoarecii consacrați Webster elvețieni de sex masculin și feminin (Taconic, Albany, NY) sau șoareci consangvinizați C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME) au fost menținuți în colonia noastră și utilizați pentru toate studiile. La prânz, în ziua în care a fost detectat un dop vaginal, a fost considerată ziua embrionară 0,5.
5. Rezultate reprezentative:
Aferente spinocerebelare fine în parasagibandele ttal din cerebel (Fig. 3; Voogd și colab. 1969; Grishkat și Eisenman 1995; Vogel și Prittie 1994; Vig și colab. 2005;. Apps și Hawkes 2009; Sillitoe și colab. 2010; . Reeber și colab. . al 2011). Am injectat trasoare WGA-Alexa în măduva spinării lombară superioară toracică inferioară pentru a demonstra: 1) că aceste trasoare pot fi utilizate pentru a eticheta încă subseturi specifice de terminale în cerebel (Fig. 3; Reeber și colab. 2011), 2). că traserele WGA-Alexa sunt intens strălucitoare și pot fi utilizate pentru a vizualiza modelul general al topografiei fibrelor mușchite din întregul cerebel (fig. 3;. Reeber și colab. 2011), 3) că WGA-Alexa 488 și 555 pot fi utilizate în combinație pentru urmărirea căilor multiple la același animal (Fig. 4) și 4) Trasatorii WGA-Alexa sunt compatibili cu colorarea imunohistochimică (Fig. 5). În lucrările recente, am arătat că terminalele de urmărire a etichetei WGA-Alexa în cerebel încă din 6 ore de la livrarea trasorului la măduva spinării și reprezintă o alegere excelentă pentru urmărirea arhitecturii căilor de dezvoltare (Reeber și colab., 2011).
Figura 2 Ilustrația pieptului inferior -. Segmentul vertebral superior lombar înainte și după laminectomia dorsală schematică a unui segment LA. vertebrale intacte din regiunea inferioară lemn-toracică-superioară a coloanei vertebrale a șoarecelui B. O dorsalaminectomie L se efectuează prin îndepărtarea proceselor spinoase ale unuia sau a două segmente vertebrale, după tăierea la jumătatea distanței dintre lamina articulară și procesul dorsal spinos.