Discutie Stagiu Marie Helene Guilleux Purificare glutamat dehidrogenază EC 1

Purificarea glutamatului dehidrogenază EC 1.4.1.4 din semințe de Pisum sativum - Marie-Hélène Guilleux - 2004

purificare

Discuție - Concluzie - Perspective

Prima parte: purificare

la. Extract brut și precipitații cu sulfat de amoniu

Prima etapă de purificare face posibilă doar obținerea unui factor de purificare apropiat de 1. În urma precipitării cu sulfat de amoniu, 64% din totalul proteinelor sunt recuperate, această etapă a contribuit, așadar, la eliminarea proteinelor.

Cu toate acestea, doar 59% din totalul activității amino GDH este recuperat. Această pierdere a activității enzimatice poate fi explicată prin inactivarea GDH după tratamentul cu sulfat de amoniu. Forța ionică ridicată indusă de sare poate provoca denaturarea enzimei.

Activitatea dezaminantă a GDH este de 14181 nmol.min -1 în extractul brut și 8448 nmol.min -1 în eșantion după precipitații cu (NH4) 2SO4. Deci, există o activitate atât de amuzantă, cât și o activitate dezaminantă. Mai multe ipoteze pot explica aceste rezultate:

b. Cromatografia cu schimb de anioni DEAE-celuloză

Neavând date despre enzima studiată, nu am știut dacă enzima se va lega sau nu de grupările dietilaminoetil (DEAE) ale gelului. 49% din activitatea aminantă totală a GDH se găsește după eluare cu NaCl. Deci, 83% din activitatea aminantă se găsește comparativ cu pasul anterior.

Proteina s-a atașat, ceea ce înseamnă că la pH 7,5, NADPH-GDH are o sarcină electrică globală negativă.

Această experiență ne oferă informații suplimentare. PKa al DEAE este de 9,5, adică la pH 9,5 DEAE are o sarcină electrică totală zero. La pH 7,5 (adică pKa-2), sarcina electrică totală a DEAE este pozitivă.

Pentru a se agăța, enzima trebuie să aibă o sarcină electrică globală negativă la pH 7,5. Astfel, deducem că punctul izoelectric al enzimei este în jur de 5,5, adică la pH 5,5, enzima poartă atâtea sarcini pozitive cât sarcini negative.

Aceste date sunt importante deoarece caracterizează enzima. Cu toate acestea, valoarea trebuie specificată pe NADPH-GDH pur.

Această etapă de purificare permite obținerea unui randament total al activității de aminare a GDH de 49% și 43% din totalul proteinelor sunt recuperate. Factorul de purificare crește și ajunge la 1,76, la fel ca și activitatea specifică a GDH (6,7 nmol.min -1 .mg -1).

În plus, pe profilul de eluare, se observă două vârfuri. Aceste două vârfuri sunt similare atât în ​​ceea ce privește activitatea totală, activitatea specifică, factorul de purificare, cantitatea de proteină totală și randamentul. Aceste două vârfuri pot fi explicate prin existența mai multor izoforme de GDH.

În ceea ce privește activitatea dezaminantă, aceasta se găsește numai în POOL 1 cu o rată de 704 nmol.min -1 .

Se pot face diferite interpretări ale rezultatelor POOL 1:

  • Poate fi activitatea dezaminantă a izoformei [EC 1.4.1.2]. În acest caz, această etapă de purificare ar fi făcut posibilă separarea parțială a izoformei [EC 1.4.1.4] de izoformă [EC 1.4.1.2] deoarece 44% din activitatea de aminare se găsește în POOL 1 împotriva 8% din dezaminare de activitate, comparativ cu etapa de precipitare a sulfatului de amoniu.
  • Aceasta poate fi activitatea dezaminantă pe care izoforma [EC 1.4.1.4] este capabilă să o aibă în mod nepreferențial, ceea ce ar reprezenta 19% din activitatea de aminare. În acest caz, ar exista doar GDH [EC 1.4.1.4] prezent în acest pool.

Nu a fost găsită nicio activitate dezamăgitoare în PISCINA 2. Din nou, acest lucru poate fi explicat prin:

  • Poate fi izoforma [EC 1.4.1.4] care a eluat mai târziu de primul grup. Acest fenomen se poate datora tratamentului cu sulfat de amoniu care poate fi modificat structura terțiară și implică, prin urmare, o diferență de comportament.
  • Poate fi izoforma [EC 1.4.1.3] care reacționează astfel în condițiile (pH) alese.

Pentru fiecare dintre cele două bazine, poate fi, de asemenea, un amestec de izoforme.

vs. Cromatografia de afinitate a pigmentului

Gelul pigmentar constă dintr-o rășină verde pe care sunt legați covalent liganzi care au o structură similară cu cea a NAD (P). Enzimele dependente de cofactorii NAD (P) se vor putea lega de acesta. Într-adevăr, majoritatea activității GDH aminante totale este recuperată după eluare cu NaCI (33% comparativ cu etapa de purificare anterioară).

O mulțime de proteine ​​totale sunt eliminate ca urmare a acestei etape (doar 2,4% din proteina totală rămâne în comparație cu etapa anterioară), ceea ce face posibilă obținerea unui factor de purificare de 23,89. Activitatea specifică crește și atinge 90,8 nmol.min -1 .mg -1, ceea ce este o dovadă a eficienței purificării.