Efectul sinergiei nutrienților asupra celulelor osteosarcomului uman U-2 OS; Dr.

M. Waheed Roomi, Vadim Ivanov, Matthias Rath și Aleksandra NiedzwieckiAutor corespondent: Alexandra Niedzwiecki, dr.

1260 Memorex Drive
Santa Clara, CA, 94050 SUA
Telefon: 408-567-5564
Fax: 408-986-9403
E-mail: [email protected]

versiune scurta

Introducere:
Terapia actuală pentru tumorile maligne primare ale osului sau țesuturilor moi care apar din celulele mezenchimale formatoare de os are un prognostic slab, în special datorită riscului crescut de chimioterapie care dezvoltă alte carcinoame. Prin urmare, sunt necesare noi strategii de tratament eficiente fără efecte secundare toxice. Studiul in vitro efectuat recent în laboratorul nostru a arătat că Nutrient Synergy (NS), o formulare unică formată din lizină, prolină, arginină, acid ascorbic și epigalocatechină galat are un efect chemopreventiv asupra diferitelor tipuri de cancer. NS a demonstrat o activitate sinergică potențială anticancerigenă prin inhibarea metaloproteinazelor matrice, enzimelor cheie împotriva invaziei și metastazelor.

Obiectiv:
Am examinat efectul sinergiei nutrienților asupra celulelor osteosarcomului uman U-2 Os prin măsurarea citotoxicității, ajustarea metaloproteinazelor matrice (MMP): MMP-2 și MMP-9 și potențialul invaziv.

Metode și substanțe:
Celulele osteosarcomului uman U-2 Os au fost cultivate în mediu McCloy, care a fost tratat cu 10% ser fetal bovin și cu plăci de cultură cu 24 de godeuri antibiotice. La confluență, celulele au fost stabilite la 0, 10, 50, 100, 500 și 1000 m g/ml sinergie de nutrienți, fiecare doză în trei exemplare. Citotoxicitatea a fost evaluată în funcție de numărul de celule măsurate prin testul MTT după 24 de ore, expresia MMP prin zimografie cu gelatinază în mediul de control și invazia de către Matrigel.

Rezultate:
Sinergia nutrienților a fost netoxică la 10 mg/ml și răspunsul actual al dozei de toxicitate de maximum 60% peste nivelul de control de 1000 mg/ml. Zimografia a arătat inhibarea dependentă de doză a producției de MMP-2 și MMP-9 prin sinergia nutrienților cu inhibare practic totală la o concentrație de 500 mg/ml. Invazia celulelor osteosarcom de către Matrigel a fost considerabil redusă la 50 mg/ml (74%) și complet inhibată la o concentrație de 100 mg/ml.

Concluzie:
Rezultatele noastre indică faptul că sinergia nutrienților este un candidat excelent pentru utilizarea terapeutică în tratamentul osteosarcomului datorită inhibării expresiei MMP, a anglogenezei și a invaziei - toți parametrii importanți și promițători pentru screeningul cancerului.

introducere

Osteosarcomul, o tumoare malignă primară a oaselor sau a țesuturilor moi care apare din celulele mezenchimale care formează oasele, se dezvoltă în general în femurul distal (osul coapsei), proximalul (spre trunchi) tibia (osul tibiei), humerusul proximal (humerus) și raza distală (spiță). Osteosarcomul clasic prezintă o creștere rapidă agresivă, cu un risc ridicat de metastaze secundare locale și metastaze pulmonare precoce. Este cel mai frecvent cancer osos și al șaselea cel mai frecvent cancer la copil, care se dezvoltă de obicei la adolescenții care se confruntă cu o creștere. Este mai frecvent la băieți decât la fete. Cele mai multe osteosarcoame provin din defecte ne-moștenite ale ADN-ului celulelor osoase în creștere. Deoarece aceste erori apar aleatoriu și imprevizibil în timpul creșterii osoase, în prezent nu este posibilă prevenirea eficientă a acestui tip de cancer (1).

Terapiile actuale pentru osteosarcom constau în intervenții chirurgicale (amputare sau intervenții chirurgicale de salvare a membrelor) și chimioterapie. Aceste terapii sunt asociate cu un prognostic slab, în special datorită naturii extrem de invazive a acestui cancer și a riscului crescut de metastazare și a dezvoltării altor tipuri de cancer din chimioterapie. Dintre 31 de pacienți aflați în studiu diagnosticați cu osteosarcom localizat (2) și care au fost tratați cu chimioterapie convențională (doză mare de metotrexat și salvare cu leucovarină la 3 pacienți și cisplatină intra-arterială la 28 de pacienți) la Centrul pentru Cancer Anderson, doar 3 pacienți nu au prezentat recidivă locală sau Metastaze pulmonare în perioada ulterioară de 225+ luni. Efectele secundare ale chimioterapiei includ, de asemenea, anemie, sângerări anormale, risc crescut de infecție datorat distrugerii măduvei osoase, ficatului și leziunilor renale, neregularităților menstruale, cistitei și sângelui în urină, osteosarcomul pielii și osteosarcomul care metastazează plămânii, creierul sau alte oase (1).

Unul dintre mecanismele cheie prin care celulele canceroase se răspândesc și se metastazează în organism implică, de asemenea, distrugerea enzimatică a țesutului conjunctiv. Încercările terapeutice de a limita acest proces cu medicamente specifice nu au avut succes și nu există în prezent alte mijloace disponibile pentru a limita metastazele cancerului. Timp de decenii, terapia standard pentru osteosarcom a constat în intervenții chirurgicale și chimioterapie, care vizează distrugerea celulelor canceroase, dar nu vizarea metastazelor. Radiațiile și chimioterapia nu sunt doar ineficiente în obținerea unei vindecări, ci atacă toate celulele fără discriminare, provocând leziuni celulare, distrugând țesutul conjunctiv și permițând astfel metastazele cancerului. Evident, este nevoie de o procedură naturală sigură și eficientă care poate limita procesul de metastazare a cancerului.

Toate tipurile de celule canceroase formează tumori prin slăbirea matricei extracelulare (ECM) cu ajutorul diferitelor metaloproteinaze matriciale (MMP). Activitatea acestor enzime merge mână în mână cu agresivitatea creșterii tumorii și intruzivitatea cancerului. În 1992, Rath și Pauling (3) au descoperit că substanțele nutritive, cum ar fi lizina și acidul ascorbic, ar putea acționa ca inhibitori naturali ai protoanalizei ECM și că au potențialul de a afecta creșterea și expansiunea tumorilor. Acești nutrienți își pot exercita efectele antitumorale prin diferite mecanisme. Acestea includ inhibarea MMP-urilor și întărirea țesutului conjunctiv care înconjoară celulele canceroase (efect de încapsulare tumorală). Într-un studiu anterior, am demonstrat acest potențial antiproliferativ și antiinvaziv al lizinei, acidului ascorbic, prolinei și epig a llocatechin gallate (ECGC) asupra cancerului de sân uman (MDA-MB 231), a celulelor canceroase de colon (colon) (HCT 115) și a tipurilor de celule melanom ( A2058) (4). Sinergia nutrienților a suprimat, de asemenea, creșterea acestor tumori fără efecte adverse la șoarecii goi. În studiul actual, am investigat potențialul antitumoral al sinergiei nutrienților in vitro pe tipurile de celule osteosarcom umane U-2 OS.

Stabilirea obiectivelor

Am examinat efectul sinergiei nutrienților (NS) asupra celulelor osteosarcomului uman U-2 OS prin măsurarea citotoxicității și reglării metaloproteinazelor matrice (MMP), MMP-2 și MMP9, precum și potențialului invaziv.

Metode și substanțe

Culturi celulare
Celulele U-2 OS osteosarcom uman au fost obținute de la ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) și crescute în mediu McCoy suplimentat cu 10% ser fetal bovin, penicilină (100 U/ml) și streptomicină (100 mg/ml ) în plăci de cultură cu 24 de godeuri (Costar, Cambridge, MA). Celulele au fost incubate cu 1 ml de mediu la 37 ° C într-un incubator de cultură de țesut (incubator) cu 95% aer și 5% CO 2 rămânând aceleași. La confluență, celulele au fost tratate cu sinergie de nutrienți, dizolvate în mediu și testate la 0, 10, 100 și 1000 mM, fiecare doză în trei exemplare. Plăcile au fost apoi plasate înapoi în incubator. Citotoxicitatea reactivilor a fost verificată după incubarea ulterioară de 24 de ore.

Testul MTT
Viabilitatea/citotoxicitatea a fost evaluată după proliferarea celulară prin testul MTT atât în medii fără ser, cât și în medii suplimentate cu 10% PBS. Mediul fără ser din celule a fost îndepărtat și testat pentru MMP. Celulele din godeuri au fost spălate cu o soluție salină amestecată cu fosfat (PBS) și 500 ml de MTT (Sigma # M-2128) 5 mg/ml în PBS au fost adăugate la fiecare godeu. Plăcile de cultură au fost incubate la 37 ° C timp de încă 2 ore. Mediul a fost aspirat cu atenție și 1 ml de DMSO (dimetil sulfoxid) a fost adăugat la fiecare pentru a dizolva cristalele de formazan albastru care s-au format. Densitatea optică a fost măsurată la 590n. OD 550 al soluției DMSO din fiecare godeu a fost vizualizat direct cu spectrofotometrul BioSpec 1501, Shimadzu. OD 590 al soluției DMSO din fiecare godeu a fost considerat a fi proporțional cu numărul de celule. OD 590 al controlului (tratament fără adăugare) a fost considerat a fi 100%.

Zimografia gelatinazei
Expresia MMP în mediul implicit a fost determinată prin zimografie cu gelatinază. Zimografia gelatinazei a fost vizualizată în gel de poliacrilamidă 10% (Bio-Rad, Hercules, CA) în prezența gelului 0,1%. Mediul de cultură (20 ml) a fost încărcat și SDS-PAGE a fost afișat cu un tampon Tris-glicină. După electroforeză, gelurile au fost spălate cu 5% Triton X-100 timp de 30 de minute. După spălare, gelurile au fost incubate timp de 24 de ore la 37 ° C, în prezența 50 mM Tris-HCI, 5 mM CaCl 2, 5 mM ZnCl 2, pH 7,5 și timp de 30 minute cu Coomessie blue R 0,5 % colorat și colorat din nou. Standardele proteice au fost urmărite continuu și s-a determinat greutatea moleculară aproximativă.

Studii de invazie Matrigel
Studiile de invazie au fost efectuate prin aplicarea inserțiilor Matrigel (Becton Dickinson) pe plăcile cu 24 de godeuri. Celulele de osteosarcom suspendate într-o soluție de mediu încărcat cu nutrienți, așa cum este specificat în proiectarea experimentului, au fost plasate în inserția godeurilor. Atât mediul de pe inserție, cât și din boluri au primit aceiași aditivi. Plăcile cu inserțiile au fost apoi incubate într-un incubator de cultură echilibrat cu 95% aer și 5% CO2 timp de 24 de ore. După incubare, mediul a fost îndepărtat din fântâni. Celulele de pe suprafața superioară a tampoanelor au fost răzuite cu atenție cu tampoane de bumbac. Celulele care au pătruns în membrana Mitragel și au migrat la suprafața inferioară a matrigelului au fost colorate cu hematoxilină și eozină și numărate optic la microscop.

Tabelul 1 - Compoziția sinergiei nutrienților
O soluție stoc de sinergie nutritivă, compusă conform proporțiilor prezentate mai jos, a fost dizolvată într-un mediu așa cum este indicat în proiectul experimentului pentru tratarea celulelor.

analize statistice
Rezultatele au fost date ca valori medii + SE pentru grupuri. Datele au fost analizate printr-un test independent „T”.