Electroforeza pe gel 2D - biologie

electroforeză bidimensională pe gel sau Electroforeză în gel 2D este o metodă analitică în biochimie, biologie moleculară și proteomică. A fost dezvoltat în 1975 de O'Farrell [1] și Klose [2] independent. Combină focalizarea izoelectrică (IEF) cu electroforeza în gel poliacrilamidă SDS (SDS-PAGE) pentru a separa amestecurile complexe de proteine (lizați bacterieni, lizați din celule sau țesuturi superioare, fluide corporale) în proteine individuale. O separare cu rezoluție deosebit de mare se realizează prin combinarea celor două tehnici de separare ortogonală.

Fiecare pată din modelul proteic corespunde unui tip (specie) de molecule proteice. Deoarece modelele de proteine din sistemele biologice se schimbă în funcție de mediu și stare, ele pot fi utilizate pentru a face diferența dintre celulele deteriorate și cele sănătoase sau crescute optim și suboptim. De exemplu, acestea oferă informații despre cauzele bolii sau mecanismul de acțiune al medicamentelor la nivel molecular. Datorită complexității modelelor bidimensionale de proteine, pentru evaluarea lor sunt utilizate programe special dezvoltate pentru computer.

pregătirea unei mostre

Proba este obținută și prelucrată în condiții cât mai identice posibil. Aceasta exclude posibilitatea ca, pe lângă variabilele experimentale care urmează să fie examinate, influențele falsificatoare să acționeze asupra eșantionului. Proteinele sunt de obicei precipitate din habitate extracelulare (proteine secretate). Proteinele intracelulare sunt extrase prin distrugerea ușoară a structurilor celulare. În afara mediului lor natural, proteinele sunt deosebit de sensibile la formarea agregatelor și degradarea de către proteaze. Mai mult, prepararea probei se efectuează la aproape 0 ° C. De regulă, se adaugă detergenți uree și neionici, precum și substanțe inhibitoare de protează, pentru a evita interacțiunile și modificările proteinelor.

Prima dimensiune (IEF)

În timpul IEF (prima dimensiune), extractul proteic este separat unidimensional într-un gel cu gradient de pH într-un câmp electric. Resturile de aminoacizi acizi și bazici ai proteinelor trec prin diferite stări de (de) protonație în funcție de valoarea pH-ului ambiant și determină astfel încărcarea proteinei. Prin urmare, acestea sunt responsabile de efectul câmpului electric asupra proteinelor. La punctul izoelectric (pI), sarcinile pozitive și negative de pe proteină se anulează reciproc. PI corespunde pH-ului la care proteina are o sarcină netă de zero. Câmpul electric nu mai acționează ca o forță asupra proteinei acum neutre în sarcină și proteina este depusă. Modificările în locație cauzate de difuzia în limitele de pH învecinate conduc la o reîncărcare electrică a proteinei. Cu toate acestea, câmpul electric reeficient promovează imediat proteina înapoi la punctul său isoelectric. Sunt disponibile două tehnologii IEF diferite.

Gradienți de pH imobilizați (IPG): banda de gel constă dintr-o matrice de poliacrilamidă. Un capăt al benzii de gel conține derivați de acrilamidă cu lanțuri laterale acide în matrice, iar cei cu grupări funcționale alcaline pe cealaltă parte. Copolimerizarea acrilamidei neutre cu derivații acizi și bazici adăugați în gradient creează un gradient de pH nemodificat, imobil.
Gradienți de pH pe baza amfoliților purtători: amfoliții purtători sunt aminoacizi sintetici și se pot deplasa liber într-o bandă de gel sau într-un gel cilindric lung (de obicei într-un tub). Când se aplică un câmp electric, acestea formează un gradient de pH care, totuși, este instabil în timp. Odată cu creșterea timpului, purtătorii de sarcină care definesc gradientul migrează la capetele gelului și mai devreme sau mai târziu își deformează cursul.

Echilibrare

În așa-numita echilibrare, care urmează separării după pI, gelul cu proteinele este inițial redus (de exemplu cu mercaptoetanol sau ditiotreitol). Aceasta servește la îndepărtarea punților disulfură. Pentru a preveni reoxidarea grupărilor rezultate -SH HS în grupări disulfură (-S-S-), grupările HS sunt z. B. alchilat cu iodoacetamidă. În cele din urmă, proteinele sunt încărcate cu dodecil sulfat de sodiu (SDS). SDS este un detergent încărcat negativ. Pentru fiecare 3 aminoacizi, aproximativ o moleculă SDS se leagă de molecula de proteină prin capătul său alifatic prin interacțiune hidrofobă. Cu partea încărcată negativ, se respinge de la capetele încărcate în vecinătatea moleculelor SDS legate. Acest lucru duce la desfășurarea completă (liniarizarea) moleculelor proteice. Cu cât este mai mare o moleculă de proteină, cu atât lanțurile rezultate sunt mai lungi încărcate cu SDS. Deoarece, în funcție de lungimea proteinei, se leagă un număr mare de molecule SDS încărcate negativ, sarcina intrinsecă poate fi neglijată pentru majoritatea proteinelor.

A doua dimensiune (SDS-PAGE)

Banda de gel cu proteinele separate și echilibrate în funcție de valoarea pH-ului este plasată pe marginea unui gel de poliacrilamidă pătrat sau dreptunghiular care conține și SDS și proteinele sunt acum separate în funcție de dimensiunea lor perpendiculară pe prima dimensiune într-o a doua electroforeză. Când se aplică câmpul electric (anod opus benzii de gel IEF), proteinele desfăcute înconjurate de SDS migrează cu excesul de sarcini negative prin gel, ceea ce oferă proteinelor o rezistență mai mare sau mai mică în funcție de mărimea lor moleculară. Moleculele mici migrează relativ netulburate și ajung rapid la marginea gelului îndreptată spre îndepărtarea de gelul IEF, în timp ce moleculele mari sunt încetinite în mod constant de gel pe măsură ce migrează și cu greu fac progrese. Separarea în cea de-a doua dimensiune este oprită atunci când proteinele mici ajung la marginea gelului cu fața îndepărtată de gelul IEF. Acest lucru este făcut vizibil de un colorant însoțitor, cum ar fi albastru de bromofenol. Pentru ca modelul proteic să rămână prezent după separare, acesta trebuie fixat într-o etapă finală. Pentru aceasta se utilizează metanol și acid acetic. Acestea denaturează proteinele separate și le conectează la matricea gelului. Acest lucru previne difuzia, iar modelul 2D este stabil în timp.