Generarea de mutanți de ștergere a genelor în cadru în Pseudomonas aeruginosa și testarea virulenței

rezumat

Aici descriem un protocol simplu și reproductibil al modelului de infecție la șoareci pentru a evalua atenuarea tulpinilor modificate genetic de Pseudomonas aeruginosa în comparație cu Escherichia coli aprobată de Administrația SUA pentru Alimente și Medicamente (FDA).

Abstract

Introducere

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Înainte de a începe experimentele pe animale, protocolul care trebuie utilizat trebuie aprobat de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (IACUC). Aprobarea protocolului descris a fost obținută de la IACUC la Universitatea Marshall (Huntington, WV, SUA).

Pentru a crea o ștergere genetică folosind plasmida pEX100T-NotI, clonați regiunile ADN care flancează secvența de ștergere dorită și introduceți-le în situsul de restricție NotI al plasmidei. Inserția de plasmidă ar trebui să conțină aproximativ 500 de nucleotide înainte de secvența țintă, care sunt direct adiacente la aproximativ 500 de nucleotide după secvența de ștergere a țintei. În plus, inserția trebuie să conțină secvența de recunoaștere NotI (GCGGCCGC) la capetele sale de 5 'și 3' (Figura 1B.).

Opțiunea 1: utilizați tehnici tradiționale de clonare. Utilizați PCR pentru a amplifica regiunile genomice înainte și după gena de interes, urmată de încrucișarea PCR 9, 10 pentru a uni fragmentele generate, digestia cu restricție endonuclează a produsului PCR și plasmidă și ligatura 11 (Figura 1B, C).
Opțiunea 2: După proiectarea secvenței de ștergere in silico, tolerați o companie care sintetizează de novo pentru ao introduce în plasmida pEX100T-NotI. Multe companii au eficientizat procesul de clonare pentru a genera rapid și eficient plasmida de interes. În plus, secvențele verifică dacă plasmidele nu prezintă mutații înainte de livrare.

Transformă E. coli electrocompetent cu plasmida conform recomandărilor producătorului. Folosind o buclă de inoculare sterilă, striați 10 l din reacția de transformare pentru coloniile izolate pe o placă de agar pre-încălzită Luria Broth (LB) suplimentată cu 100 g/ml carbenicilină și incubați peste noapte la 37 ° C.
NOTĂ: Toate echipamentele și mediile utilizate pentru cultivarea bacteriilor trebuie manipulate în conformitate cu liniile directoare instituționale de siguranță.
Treci de două ori.
1. Scoateți placa din incubator și identificați o colonie izolată. Folosind o buclă de inoculare sterilă, ridicați colonia și dezbrăcați o placă de agar LB preîncălzită suplimentată cu 100 g/ml carbenicilină pentru coloniile izolate. Se incubează peste noapte la 37 ° C. Repetați din nou acest pas pentru a genera o cultură pură.
Folosind o buclă de inoculare sterilă, inoculați 5 ml de LB cu o singură colonie din ultima placă de agar. Așezați cultura într-un incubator care se agită la 37 ° C peste noapte. A doua zi, se amestecă 1 ml din această cultură cu 1 ml de 5% într-o criovială și se păstrează la -80 ° C pentru a crea un stoc congelat al soiului.

4. Pregătirea distensiei bacteriene și conjugarea triparentală

5. Detectarea recombinanților cu un singur crossover P. aeruginosa

6. Detectarea P. aeruginosa dublă peste recombinați

Pentru fiecare cultură de bulion, inoculați 10 L de cultură pe o placă PIA preîncălzită, suplimentată cu zaharoză 10% (fără glicerol) și benzi pentru colonii izolate. Incubați plăcile peste noapte la 37 ° C.
A doua zi, scoateți plăcile din incubator și examinați pentru creștere. Coloniile rezistente la zaharoză ar trebui să fie recombinante duble încrucișate (adică au îndepărtat plasmida din cromozom printr-un eveniment de recombinare între cealaltă regiune omologă a inserției plasmidice și cromozomul P. aeruginosa).
1. Mușcă deschise cel puțin 20 de colonii cu scobitori sterili pe plăci preîncălzite de: 1) PIA, 2) PIA suplimentată cu zaharoză 10% (fără glicerină) și 3) PIA suplimentată cu 300 g/ml carbenicilină.
Se incubează plăcile peste noapte la 37 ° C.
Scoateți plăcile din incubator și examinați-le pentru a crește. Adevăratele recombinante duble încrucișate vor fi sensibile la carbenicilină și rezistente la zaharoză (adică colonii care au crescut pe PIA și PIA suplimentate cu zaharoză, dar nu au crescut pe PIA suplimentate cu carbenicilină).

7. Confirmarea ștergerii genelor prin Colony PCR

8. Pregătiți tulpina bacteriană pentru testarea pe animale

VE2 și PGN5:
aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
aroA R: ATCTGGCTCGATGCCGGTCC

Incubați culturile într-un incubator de agitare la 160 rpm și 37 ° C până când acestea ating creșterea fazei log (adică măsurarea OD600 de 0,4-0,6 pe un spectrofotometru).

Folosind OD600 obținut din faza de logare realizată, calculați volumul de bulion necesar pentru a da 2,5 x 10 9 unități de imagine de colonie (CFU) per ml. Se peletează volumul bulionului în tuburi de 50 ml la 4.500 x g timp de 10 min.

Aruncați supernatantul și înlocuiți peleta într-un tub cu 50 ml 1x PBS pentru a spăla celulele. Centrifugați din nou la 4.500 x g timp de 10 minute.

Aruncați supernatantul și agățați din nou peleta în 25 ml de lapte degresat 5% în 1x PBS.

Etapa de validare: Utilizați un eșantion de resuspensie de 25 ml pentru a efectua numărarea viabilă a plăcilor pentru a determina numărul de CFU/ml.

Alicotați resuspendarea culturii de lapte degresat de 25 ml în stocuri de cultură de 2 ml în crioviale de 2 ml. Se congelează blițul în azot lichid și se păstrează la -80 ° C cel puțin peste noapte înainte de utilizare.

9. Validarea stocurilor de creștere și tulpină care vor fi păstrate pentru testarea pe animale.

Pentru fiecare soi care urmează să fie testat, îndepărtați cel puțin 3 crioviale din stocurile înghețate din depozitul de -80 ° C și dezghețați la 4 ° C timp de 2-4 ore. Dacă a rămas o cantitate înghețată, se încălzește scurt la 37 ° C.
Luați probe mici din fiecare criovial pentru a valida fiecare soi.
1. Efectuați un număr de plăci viabil pentru a determina numărul de CFU/ml. Este normal să aveți mai puțin CFU/ml după îngheț, din cauza morții unor celule bacteriene.
2. Utilizați PCR și primeri specifici întinderii pentru a valida fiecare tulpină.
3. Glisați fiecare tipărire pe suport selectiv pentru a verifica fenotipul.
După confirmarea faptului că tulpinile au genotipul și fenotipul corect și validarea CFU/ml, treceți la testarea pe animale.

10. Vaccinarea animalelor cu tulpini bacteriene prin injecție

11. Analiza statistică a mortalității animale

12. Vizualizați infecția cu bioluminiscență

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Ca în Figura 2Așa cum se arată, ștergerea genomică vizată poate fi confirmată cu PCR de colonie cu primeri specifici care întăresc regiunea de interes. Coloniile care au o ștergere genomică au ca rezultat o dimensiune mai mică a benzii PCR comparativ cu coloniile de tip sălbatic. Un ecran PCR de 10-12 colonii este de obicei suficient pentru a detecta cel puțin o colonie care poartă ștergerea țintită. Dacă ștergerile nu sunt detectate după mai multe runde de ecran, repetați procesul care începe cu conjugarea. Dacă ștergerea nu reușește încă, este posibil să fie necesară confirmarea implementării plasmidei prin secvențierea, reproiectarea sau secvența fatală. După verificarea ștergerii genei prin PCR, confirmați ștergerea prin secvențiere. Tulpina rezultată poate fi supusă în mod repetat procesului pentru a produce modificări genomice secvențiale.

Ca în Figura 3Așa cum se arată, mortalitatea asociată cu injecția intraperitoneală a tulpinii atenuate de P. aeruginosa PGN5 (+ mucE) a fost de 0%, ceea ce a fost același cu cel observat cu E. coli BL21. Pe de altă parte, injecția intraperitoneală a tulpinei părinte (VE2) a fost fatală pentru 80% dintre șoareci. Aceste rezultate au fost obținute cu etape ample pentru validarea tulpinilor injectate. În timp ce cauza exactă a decesului la acești șoareci este necunoscută, aceasta poate fi urmărită, cel puțin parțial, la expresia factorilor de virulență din tulpina părinte care au fost șterse din tulpina PGN5 atenuată. Diferențele în progresia infecției au fost urmate cu părinții etichetați cu bioluminiscență și cu tulpini atenuate. Tulpina atenuată a rămas localizată la locul injectării până când bioluminiscența a dispărut (Figura 4). Clearance-ul infecției a coincis cel mai probabil cu estomparea bioluminiscenței. Bioluminiscența nu a fost detectată la 24 de ore de la injectare și șoarecii au trăit săptămâni după injecție până când au fost sacrificați fără efecte secundare observate.

Figura 2: Electroforeza pe gel a produselor PCR de colonie dintr-un ecran de ștergere aroA pentru a genera tulpina de P. aeruginosa atenuată, PGN5. Produsele PCR de colonie care rulează pe benzile 2-5 și 8-11 prezintă colonii cu aroA de tip sălbatic. Produsele PCR de colonie care rulează pe benzile 6 și 7 poartă ștergerea genei era, care este indicată de produsul PCR mai mic (asterisc galben). Primerii utilizați au îmbunătățit în mod specific regiunea genomică care conține gena aroA: aroA-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGCUND și aroA-R: ATCTGGCTCGCTCTGCCGGTCC. Mărimea așteptată a produsului PCR în coloniile sălbatice a fost de 2548 nucleotide (nt). Dimensiunea preconizată a produsului PCR în colonii cu ștergere aroA a fost de 307 nt. O scară ADN a fost direcționată pe benzile 1 și 12. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 3: Mortalitatea generală a șoarecilor infectați cu tulpina patogenă P. aeruginosa (VE2), tulpina P. aeruginosa atenuată (PGN5 + mucE) și controlul FDA E. tulpina coli (BL21). Doar șoarecii injectați cu tulpina mamă patogenă au avut o mortalitate de 80%. Tulpina atenuată P. aeruginosa și controlul FDA E. tulpina coli a avut o mortalitate de 0%. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 4: Imagine a șoarecelui la 3 ore după injectarea unei tulpini atenuate de P. aeruginosa PGN5 + mucE cu un marker bioluminiscent. Bacteriile bioluminescente au fost detectabile până la 18-24 ore după injectare. În acest timp, bioluminiscența a rămas la locul injectării, sugerând că bacteriile au rămas localizate la locul injectării. Acest mouse a recuperat complet, fără efecte adverse. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Plasmida pEX100T-Not1 este un mediator eficient al delețiilor genomice secvențiale care sunt libere de markeri și în cadru. Atunci când se dezvoltă tulpini de bacterii pentru virulența atenuată, ștergerea unor secvențe genetice întregi, mai degrabă decât generarea mutațiilor punctuale, reduce probabilitatea revenirii la un fenotip virulent. În plus, fiecare ștergere a genei patogenității amortizează și mai mult agentul patogen și crește stabilitatea amortizării.

Această metodă poate fi, de asemenea, utilizată pentru a crea alte modificări genomice decât ștergerile, cum ar fi mutații punctuale și inserții, pur și simplu prin schimbarea designului inserției plasmidice. Aceste tipuri de modificări pot fi mai utile decât ștergerile de gene întregi pentru bacteriile tehnice cu metabolism modificat, de exemplu. Modificarea genomică secvențială are un potențial semnificativ pentru generarea de tulpini de bacterii proiectante în scopuri specifice în cercetare și industrie. Au fost descrise alte metode pentru generarea modificărilor genomice fără markeri dorite la bacterii 15, 16, 17, 18. Ca și în cazul tuturor metodelor de editare a genomului, încercările de modificare a regiunilor esențiale ale genomului pot fi fatale și, prin urmare, nereușite. În aceste cazuri, identificarea diferitelor modificări genetice sau a altor gene candidate este necesară pentru a genera tulpina bacteriană de interes.

Având în vedere numeroasele evenimente de replicare și pasaje ale fiecărei colonii din acest protocol, vor avea loc modificări neintenționate în genomul cultivarului produs. Modificările genomice exacte pot fi identificate prin secvențierea întregului genom. Cu toate acestea, efectele acestor schimbări sunt mai greu de determinat. Atunci când se dezvoltă bacterii pentru un scop specific, sunt tolerabile modificările genomice care nu afectează negativ creșterea organismului sau căile țintă. În funcție de tulpina generată, poate fi posibilă identificarea unei „citiri” pentru a se asigura că soiul continuă să fie util pentru scopul propus. De exemplu, cu PGN5 scopul a fost de a crea o tulpină atenuată care să păstreze capacitatea de a produce cantități mari de alginat. După ștergerea a cinci gene de patogenitate, cantitatea și compoziția alginatului produs de PGN5 au fost măsurate și s-au constatat că sunt comparabile cu alte tulpini producătoare de alginat. Producția de alginat nu a fost afectată de cele cinci deleții genetice sau de modificările genomice neintenționate care au avut loc în timpul dezvoltării PGN5.

Utilizarea bioluminiscenței ca marker permite validarea suplimentară a tulpinilor bacteriene injectate, deoarece markerul poate fi vizualizat la locul injectării. Introducerea markerului bioluminiscent în cromozomul bacterian este necesară pentru imagistica bioluminiscentă, dar poate să nu fie posibilă atunci când se lucrează cu tulpini/specii incompatibile. Cu toate acestea, etichetarea tulpinilor cu bioluminiscență nu este necesară pentru a testa atenuarea. Tulpinile testate în acest studiu au fost etichetate cu bioluminiscență, ceea ce a permis vizualizarea diferențelor de localizare dintre tulpini pe parcursul infecției. Am observat că tulpina patogenă s-a răspândit prin corpul șoarecelui, dar tulpina nepatogenă a rămas la locul injectării. În timp ce acest experiment a testat doar două tulpini foarte strâns legate de P. aeruginosage, sugerează că răspândirea bacteriană este asociată cu virulența, cel puțin la P. aeruginosa. Această metodă de etichetare cu bioluminiscență ar putea fi utilizată pentru a vizualiza evoluția infecției în viitor, pentru a evalua rapid atenuarea tulpinilor bacteriene tehnice.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Autorul, Hongwei D. Yu este șef șef și co-fondator al Progenesis Technologies, LLC.