Hrănire cu diete bogate în grăsimi și test de triacilgliceridă de mare viteză în Drosophila Melanogaster
rezumat
Acesta este un protocol de hranire cu dieta bogata in grasimi folosit pentru a induce obezitatea la Drosophila, un model pentru intelegerea mecanismelor moleculare de baza implicate in lipotoxicitate. De asemenea, oferă o analiză a triacilgliceridelor cu un randament ridicat pentru măsurarea acumulării de grăsime în Drosophila și, eventual, în alte modele (de insecte) în diferite condiții dietetice, de mediu, genetice sau fiziologice.
Abstract
Bolile de inimă sunt principala cauză de deces uman la nivel mondial. Numeroase studii au arătat legături puternice între obezitate și tulburări cardiace la om, dar sunt necesare mai multe instrumente și cercetări pentru a elucida mai bine mecanismele. De mai bine de un secol, modelul genetic foarte docil al Drosophila a fost esențial în descoperirea genelor cheie și a căilor de semnalizare moleculară care s-au dovedit a fi extrem de conservate dincolo de limitele speciilor. Multe procese biologice și mecanisme ale bolii sunt păstrate funcțional în zbor, cum ar fi dezvoltarea (de exemplu, planul corpului, inima), cancerul și bolile neurodegenerative. Recent, studiul obezității și al bolilor secundare, cum ar fi bolile cardiovasculare la organismele model, au jucat un rol foarte important în identificarea principalilor regulatori implicați în sindromul metabolic la om.
Aici ne propunem să folosim acest model de organism ca un instrument eficient pentru a induce obezitatea, adică adică, utilizați acumularea excesivă de grăsimi și dezvoltați un protocol eficient pentru monitorizarea conținutului de grăsime sub formă de acumulare TAG. În plus față de genomul foarte conservat, dar mai puțin complex, musca are și o durată scurtă de viață pentru experimentele rapide, combinate cu economia. Acest articol oferă un protocol detaliat pentru alimentarea cu dietă bogată în grăsimi (HFD) în Drosophila, obezitatea și o analiză de triacilgliceridă cu randament ridicat (TAG) pentru măsurarea creșterii asociate conținutului de grăsimi, cu scopul de a induce o mare reproductibilitate și eficiență pentru cei mari screening genetic sau chimic. Aceste protocoale oferă noi oportunități de a examina în mod eficient mecanismele de reglementare implicate în obezitate, precum și oferă o platformă standardizată pentru cercetarea descoperirii medicamentelor pentru evaluarea rapidă a efectelor candidaților la medicamente asupra dezvoltării sau prevenirii obezității, diabetului și bolilor metabolice.
Introducere
Mâncarea HFD în sine constă dintr-un aliment standard cu muște suplimentat cu ulei de cocos, constând în principal din grăsimi saturate cunoscute a fi asociate cu sindromul metabolic 18. În timp ce obezitatea la modelele de mamifere, cum ar fi rozătoarele, poate dura luni de inducție 19, 20, protocolul nostru optimizat de HFD în hrănirea cu Drosophila a crescut în mod eficient și reproductibil conținutul de grăsime din organism în câteva zile 12, 14. Acest protocol, coroborat cu un test TAG cu randament ridicat, permite screening-ul eficient în masă pentru efectele factorilor genetici, influențelor de mediu și candidaților la medicamente pentru a descoperi noi modulatori ai metabolismului lipidelor. Ca urmare, aceste protocoale ar trebui să înțeleagă și/sau să combată bolile umane legate de supraponderalitate și obezitate.
Protocolul de hrănire este versatil și poate fi utilizat pentru a studia efectele metabolice și funcționale ale oricărui acid gras saturat sau nesaturat. Utilizarea testelor TAG de mare viteză nu se limitează la D. melanogaster, ci poate fi adaptată la o varietate de organisme mici model cu cuticule sau matrice extracelulare dure (de exemplu, alte specii de Drosophila, C. elegans și alte nevertebrate model) conținut de grăsime măsură în diferite condiții ecologice, genetice și fiziologice, în orice stadiu de dezvoltare, maturitate sau stadiu al bolii metabolice. Testul TAG se bazează pe o măsurare colorimetrică a unei serii de reacții enzimatice care degradează TAG-urile în acizi grași liberi, glicerol, glicerol-3-fosfat și în cele din urmă H2O2, care se face cu 4-aminoantipirină (4-AAP) și 3,5- dicloro-2-hidroxibenzen sulfonatul (3,5 DHBS) reacționează pentru a produce un produs de culoare roșie care se măsoară cu un spectrofotometru cu 96 de godeuri.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
1. Protocol de alimentare HFD
Acest tabel rezumă diferitele ingrediente utilizate pentru a ne pregăti controlul. Odată formate, 10 ml de alimente sunt turnate în flacoane, refrigerate și depozitate la 4 ° C pentru depozitare pe termen lung.
ilustrația 1 . HFD hrănirea în Drosophila.
Schema arată diferitele etape de hrănire pentru muște pe un aliment de control (dietă normală fără adăugarea de ulei de cocos NF) sau HFD (cu adăugarea de ulei de cocos). Întregul proces durează 10 zile după prima colecție pentru adulți. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
La D. Melanogaster, ca și în cazul altor specii, există dimorfism sexual între bărbați și femele 22. Se știe că femelele sunt mai mari, cu mai multe grăsimi în burtă, decât masculii 22. Pentru a testa eficacitatea protocolului nostru, am făcut teste TAG pentru a determina diferențele de conținut TAG între muștele de tip sălbatic de laborator standard masculin și feminin (w 1118). Datele arată că femeile au mai multe grăsimi corporale decât omologii lor masculini (Figura 2A, B). Datele au arătat, de asemenea, că testele sunt stabile, fără variații ale cuantificării TAG în timp (până la 50 de minute după incubare) și fără fluctuații în funcție de mărimea eșantionului biologic (3 sau 5 muște).
S-a demonstrat că consumul de HFD cauzează obezitate la oameni și șoareci 19, 20, 23. Pentru a testa eficacitatea protocolului nostru de hrănire, am folosit teste TAG cu HFD și am controlat muște femele hrănite. Am constatat că consumul de HFD în Drosophila a determinat un conținut crescut de grăsimi, care s-a acumulat treptat în timp (Figura 3A-C). O altă constatare importantă este că după doar 18 ore de hrănire cu HFD (Fig. 3C.), am putut induce o creștere semnificativă a conținutului de grăsime la aceste muște. Aceste rezultate sugerează că acest model de sistem genetic este un instrument ideal pentru cercetarea accelerată pentru a găsi noi regulatori ai obezității induse de HFD.
Figura 2 . Analize TAG la muște masculine și femele.
Au fost colectate muște vechi de 2 săptămâni, care au urmat o dietă normală, grupate după sex (masculi și femele), cântărite și măcinate (3 sau 5 muște pe godeu) pentru analiza TAG. Testele TAG au fost efectuate conform procedurilor descrise în acest document. Absorbanța fiecărei probe la 550 nm a fost citită în diferite momente de timp (0 min, 5 min, 20 min și 50 min) pentru a determina eventualele fluctuații ale cuantificării TAG, citite în timp, variația conținutului de grăsime în diferite dimensiuni ale populației (3 și 5 zboară) w 1118 muște și diferențe între conținutul TAG masculin și feminin. Rezultatele au arătat că femeile aveau mai multă grăsime decât omologii lor masculini (A.-B.) se acumulează, măsurătorile TAG nu fluctuează până la 50 de minute. după incubarea reacției la 37 ° C (A.-B.). Chiar și nivelurile medii de TAG rămân neschimbate între testele TAG cu 3 sau 5 muște (A.-B.). Datele sunt prezentate ca statistici medii ± SEM: nicio diferență semnificativă. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.
Figura 3 . Afectează acumularea de grăsime HFD.Din: Muștele femele în vârstă de 2 săptămâni crescute la un nivel normal sau HFD timp de 5 zile au fost colectate și testele TAG au fost efectuate pentru a determina grăsimea. Conținutul TAG a fost fie ponderat (A.) sau nivel proteic (B.) normalizat. Datele au arătat că consumul de HFD duce la creșterea nivelului de grăsime cu ambele metode de normalizare. C: Femelele în vârstă de 2 săptămâni pe alimente normale/martor (NF) și 18 ore, 1 zi sau 2 zile pe HFD sunt examinate pentru conținutul TAG. Rezultatele arată o creștere marcată și progresivă a nivelurilor TAG de la 18 ore la 2 zile de expunere la HFD. Datele sunt prezentate ca statistici medii ± SEM: Testul t al elevului. * p Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
Inducerea obezității la șoareci poate dura 19, 20 de luni. La muște, acest protocol de hrănire HFD permite inducerea acumulării excesive de grăsime în câteva zile sau mai puțin, provocând creșteri ale acumulării de grăsime numai după ora 18:00 (vezi Figura 2). Hrănirea HFD cu protocolul descris crește sau scade conținutul de glucoză 12, lipaza Bmm și expresia PGC-1 24. Acest lucru este în contrast cu Drosophila la post de adulți, care a provocat o scădere rapidă a conținutului de grăsimi și glucoză 25, 26 și creșterea expresiei Bmm 24. De asemenea, ridică nivelurile de Bmm sau PGC-1 pentru a proteja obezitatea indusă de HFD 14, 24. În timp ce 30% HFD a fost utilizat în acest protocol, zburați cu 3%, 7% sau 15% hrănire cu grăsime obezitate indusă într-un mod de dietă dependentă de doză 12, cum ar fi creșterea duratei hrănirii HFD (Figura 3). Am constatat, de asemenea, că acizii grași individuali erau principalele componente ale uleiului de cocos, adică adică, 14% acid lauric sau 5% hrănire cu acid miristic, determină o creștere semnificativă a acumulării de grăsime 12 .
Răspunsul metabolic accelerat cu aceste muște la terapia cu HFD este corelat cu o durată de viață redusă 27, așa cum sa observat la mamiferele 28, dar observat> 80% din muște supraviețuiesc în ultimele 20 de zile cu HFD 27. Inducerea rapidă a acumulării de grăsime mediată de procesele celulare și moleculare conservate metabolismul lipidelor și glucozei este benefică pentru multe studii privind obezitatea, cum ar fi: B. Cardiomiopatia diabetică sau lipotoxică 10, 12, 13, 14, 15, 16. O perspectivă importantă asupra consecințelor dezechilibrelor metabolice și a disfuncției cardiace asociate vor permite probabil studii translative comparative la om.
Protocolul de hrănire HFD este compatibil pentru utilizare cu alte specii de Drosophila și modele de insecte care împărtășesc diete similare cu D. melanogasters. Aceste protocoale de hrănire HFD ar putea fi adaptate în consecință pentru organisme precum C. elegans sau chiar alte insecte care necesită alte medii alimentare „normale”. HFD de 30% nu este potrivit pentru utilizare în experimente care necesită temperaturi ridicate; Cu toate acestea, concentrații mai mici de ulei de cocos sau acizi grași individuali ar putea fi alternative adecvate 12 .
Obezitatea, sindromul metabolic și bolile asociate sunt în orice moment maxime cu efecte catastrofale asupra sănătății umane 1, 2. Protocolul HFD combinat și testul TAG cu randament ridicat oferă o platformă unică pentru a utiliza organisme model, cum ar fi Drosophila, pentru a induce obezitatea rapid și pentru a depista factorii genetici sau pentru a utiliza compuși chimici naturali și sintetici pentru a înțelege mai bine dezechilibrul metabolic. În cele din urmă, acest lucru ar putea contribui în mod semnificativ la avansarea cunoștințelor științifice pentru dezvoltarea de noi metode de tratament sau remedii pentru bolile metabolice.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.