Identificarea bacteriilor metabolice active în intestinul Spodoptera littoralis generalist

rezumat

Comunitatea bacteriană activă asociată cu intestinul Spodoptera littoralis a fost determinată prin sondare stabilă a izotopilor (SIP) cuplată la pirosequencing. Cu această metodă, identificarea speciilor bacteriene active din punct de vedere metabolic în cadrul comunității a fost efectuată cu rezoluție și precizie ridicate.

Abstract

Intestinele majorității insectelor nu sunt locuite patogen de comunități complexe de bacterii simbiotice. În cadrul acestor comunități microbiene este posibil să venim sau să identificăm specii bacteriene mutualiste. S-a observat că acestea din urmă îndeplinesc funcții multiple insectei, ajutând astfel la reproducerea insectelor, promovând răspunsul imunitar 2, producerea de feromoni 3, precum și nutriția, inclusiv sinteza aminoacizilor esențiali 4, printre altele.

Datorită importanței acestor asociații, s-au făcut multe eforturi pentru a caracteriza parohiile până la membrii individuali. Cele mai multe dintre aceste eforturi s-au bazat fie pe metode de cultivare, fie pe generarea de fragmente de gene 16S rRNA care au fost secvențiate pentru identificarea finală. Din păcate, aceste abordări sunt recunoscute doar care există în speciile bacteriene intestinale și nu au furnizat informații despre activitatea metabolică a microorganismelor.

Pentru a caracteriza speciile bacteriene active din punct de vedere metabolic în intestinul unei insecte, am utilizat in vivo testarea izotopului stabil (SIP) aplicând 13 C-glucoză ca substrat universal. Aceasta este o tehnică promițătoare fără cultură care permite legăturilor genealogice microbiene să fie legate de activitatea lor metabolică particulară. Acest lucru este posibil prin urmărirea atomilor stabili marcați cu izotopi din substraturi din biomarkeri microbieni precum ADN și ARN 5. Încorporarea izotopilor 13 C în ADN crește densitatea ADN-ului marcat comparativ cu cel nemarcat (12 C). La sfârșit, ADN-ul sau ARN-ul marcat cu 13 C este separat de cel 6 similar fără etichetă 12 C prin ultracentrifugare cu gradient de densitate. Analiza moleculară ulterioară a izotopologilor separați ai acidului nucleic stabilește legătura dintre activitatea metabolică și identitatea speciei.

Aici vă prezentăm protocolul utilizat pentru a caracteriza bacteriile metabolice active din intestinul generalistului insectelor (sistemul nostru model), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Analiza filogenetică a ADN-ului a fost făcută folosind piroseqüențierea, ceea ce permite rezoluția și precizia ridicate în identificarea comunităților bacteriene intestinale ale insectelor. Glucoza marcată cu 13 C a fost utilizată ca substrat principal în experimente. Substratul a fost alimentat cu o dietă artificială pe insecte.

Introducere

Odată cu apariția tehnologiilor de secvențiere bazate pe PCR, numărul studiilor care utilizează biota intestinală de la mai multe organisme (adică oameni, insecte sau organisme marine) este în creștere. În plus, rezultatele izolării și cultivării bacteriilor care adăpostesc intestinal sunt independente decât în ​​trecut. Aproape 99% din bacterii nu pot fi cultivate și este dificil să simulăm condițiile de mediu predominante în intestinul 12. Folosind PCR, fragmentele genei 16S rRNA (o genă marker filogenetică folosită pe scară largă în rândul bacteriilor) ar putea fi extrase selectiv dintr-un șablon mixt de ADN al comunităților bacteriene intestinale, secvențiat, amplificat, clonat. Cu aceste informații, utilizatorul poate identifica speciile bacteriene după colectarea informațiilor secvenței din bazele de date publice 13, 14. Cu toate acestea, secvențierea abordărilor pentru a descrie comunitățile bacteriene inadecvat din cauza lipsei de informații despre contribuția metabolică a fiecărei specii în cadrul comunității.

Aici folosim 13 C-glucoză pentru a „eticheta” ADN-ul speciilor bacteriene active din punct de vedere metabolic din intestin. Glucoza este un zahăr utilizat de majoritatea speciilor bacteriene de-a lungul căii larg răspândite Entner-Doudoroff (ED), deși sunt cunoscute excepții 20. Acest lucru justifică utilizarea 13 C-glucozei ca o sondă metabolică fiabilă care conectează metaboliții de interes și Sursa de carbon de-a lungul căilor stabilite. În funcție de problema științifică, alte substraturi, adică 13 C-metan, 13 CO 2 sau plante sub o atmosferă de 13 CO 2, pot fi utilizate pentru a aborda activitățile metabolice.

În acest moment, vă prezentăm protocolul utilizat în caracterizarea metabolică a comunității bacteriene din intestinul generalistului insectelor, și anume S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). În plus, metoda a fost cuplată cu piroseqüențierea, care la rândul său permite identificarea comunităților bacteriene intestinale ale insectelor cu rezoluție și precizie ridicate. Glucoza marcată cu 13 C a fost utilizată ca substrat principal în experimente.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

1. Cumpărați sau obțineți ouă de ambreiaje Spodoptera littoralis de la propria unitate de creștere. Păstrați-le în cutii Petri sterile la temperatura camerei (RT) până la eclozare.
2. Pregătiți hrana artificială pentru creșterea insectelor după cum urmează:
   1. Înmuiați 500 g de fasole albă măcinată peste noapte în 100 ml de apă.
   2. Adăugați 9,0 g de acid ascorbic și 75 g de agar la 1000 ml de H20 distilat și apoi fierbeți.
   3. Lăsați amestecul să se răcească și când se solidifică (până la un amestec solid ceros alb) păstrați-l la 4 ° C până la utilizare.
3. Transferați larvele nou eclozionate într-un borcan de plastic curat și puneți-le pe sistemul artificial de alimentare la 23-25 ​​° C într-o zi lungă cu un regim de iluminare de 16 ore și 8 ore de întuneric. Schimbați alimentele în fiecare zi până când larvele trec prin toate cele șase etape larvare.

2. Marcarea 13 C a ADN-ului în bacteriile intestinale metabolice active

1. Se dizolvă 186,1 mg de glucoză complet marcată cu 13 C cu apă distilată și deionizată (ddH20) și se amestecă bine cu 100 g de alimente artificiale pentru experimentul SIP. Asigurați o concentrație finală de 13 C-glucoză de 10 mM în hrana artificială. Aceasta imită concentrația de glucoză in situ în intestinul larvelor S. littoralis pe plantele de bumbac conform Shao și colab. (trimis).
2. Aproximativ 9-15 stele larvare sănătoase de la cutia de creștere la cutii Petri din plastic sterile (o larvă pe cutie Petri) cu 13 C-glucoză proaspătă amestecată cu nutriție artificială. Nutriție artificială cu aceeași cantitate de glucoză nativă (12 C-glucoză) descrisă pentru hrănirea grupului de control.
3. Reînnoiți hrănirea artificială frecvent în timpul perioadei de incubație (1 zi). Folosiți condițiile de creștere ca la pasul 1.3.
4. Colectați nouă larve din fiecare tratament pentru procesare ulterioară (extracție ADN). Fiecare replică este formată din trei persoane, efectuând cel puțin trei repetări pe tratament.

4. Extracția și amplificarea ADN-ului

6. Caracterizarea ADN-ului prin pirosecvențiere

7. Analiza datelor pirozecvențiale

1. Analizați segmentele secvenței brute generate de 454 piroza secvențial folosind „Insights Quantitative into Microbial Ecology”, software-ul QIIME 26. Efectuați procesarea după cum urmează:
   1. Mai întâi convertiți fișierul sff generat de mașină 454 în fișiere FASTA, QUAL și Flowgram cu process_sff.py scenariu.
   2. Confirmați fișierul de mapare (pe baza check_id_map.py) și atribuiți citiri multiplex semințelor biologice cu split_libraries.py Script. Tăiați capetele de calitate scăzută cu o dimensiune a ferestrei glisante de 50 și o tăiere de calitate medie de 25, chiar eliminați secvențe scurte ambigue (lungimea Abonament necesar. Vă recomandăm JoVE bibliotecarului dvs.

   Rezultate reprezentative

   După ultracentrifugare, odată confirmată cantitatea de ADN separată în fiecare fracție și măsurarea densității, se trasează densitatea fracției medii în g/ml peste numărul fracției pentru a determina formarea corectă a pantei în tuburi, care include de obicei un interval de densitate de confirmare de la 1,690 (pentru fracțiunea 12 sau 11) la 1,760 g/ml g/ml (pentru fracția 1). Pirozecventarea cantitativă se realizează direct pe gradientul SIP reprezentativ pentru a releva speciile de linie și abundența relativă (Figura 2 ). Aici am secvențiat fracțiunile grele atât din eșantionul modificat cu 13 C-glucoză, cât și din controlul nemarcat care a servit la profilarea populațiilor active din comunitate. După secvențiere, au fost generate un total de 120.045 citiri de înaltă calitate cu o lungime medie de 404 nucleotide. Profilul de pirosecvențiere a arătat o frecvență crescută a anumitor specii, inclusiv Enterococcus și Pantoea în proba marcată (ADN marcat cu 13 C, Fig. 3) comparativ cu grupul de control (12 C ADN de control, Figura 3). Prin urmare, bacteriile ar trebui considerate active din punct de vedere metabolic și merită un studiu suplimentar.

   
   1. Experiment de alimentare cu 13 C-glucoză, extracție ADN și amplificare PCR a genei 16S rRNA E. (A) Hrănire artificială modificată cu 13 glucoză C consumată de larvele Spodoptera littoralis. (B) Nativii Glucoza (12 C-glucoză) s-a transformat în hrănirea artificială a larvelor din același lot de insecte (A) folosit care servește drept control consumat . (C) Extract tipic de ADN metagenom din țesutul intestinal al larvelor din grupul de tratament cu 13 C-glucoză și 12 din grupul de control C-glucoză. Trei replici biologice (benzile 1, 2 și 3) sunt incluse în fiecare grup. M înseamnă marker ADN de 1 kb. (D) Amplificarea PCR cu un set de primer bacterian universal generează produsele corecte ale genei ARNr de 16 kb 16S folosind ADN-ul metagenomic extras ca șablon. Linia 1 este controlul pozitiv PCR. Banda 2 și 3 stabilesc proba tratată cu 13 C-glucoză și controlul cu 12 C-zahăr. jpg "target =" _blank "> Faceți clic aici pentru o vizualizare mai mare.
   
   2. Proiectarea unui experiment Pyro-SIP cu ultracentrifugare cu gradient de densitate CsCl și fracțiune cu caracterizare pirozecvență a ADN-ului separat. H = abundență mai mare, L = abundență și abundență mai mică. Faceți clic aici pentru o vizualizare mai mare .
   
   3. Diversitatea bacteriană și abundența relativă în fracțiunile grele ale larvelor native alimentate cu glucoză (ADN control 12 C) și larve alimentate 13 C-glucoză (ADN marcat 13 C)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Faceți clic aici pentru o vizualizare mai mare.

   Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

   Discuţie

   Colectiv, protocolul descris aici oferă o metodă simplă, rapidă și eficientă pentru determinarea activităților metabolice ale florei intestinale, care ar putea fi aplicată în continuare pentru a evalua rolul specific al simbionților bakenriali în nutriția, detoxifierea și apărarea gazdei.

   Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

   ---