Identificarea factorilor de transcripție a siturilor de legare genomică Olig2 în PDGFR purificat acut; Celule de
rezumat
Aici vă prezentăm un protocol conceput pentru a analiza legarea la nivelul genomului a factorului de transcripție oligodendrocit 2 (Olig2) în celulele progenitoare ale oligodendrocitelor cerebrale purificate acut (OPC) prin efectuarea imunoprecipitării cu cromatină cu celule scăzute (ChIP), pregătirea bibliotecii, secvențierea de mare viteză și analiza bioinformatică a datelor.
Abstract
Introducere
Este important să se studieze legarea de proteine (sau complexe proteice) de ADN și markerii epigenetici pentru a construi rețele de reglare transcripționale în diferite procese biologice. În special, legăturile dintre factorii de transcripție și ADN-ul genomic pot juca un rol important în reglarea genelor, diferențierea celulară și dezvoltarea țesuturilor. Este un instrument puternic pentru studierea reglării transcripționale și a mecanismelor epigenetice ale imunoprecipitării cromatinei (ChIP). Datorită progreselor rapide în tehnologia de secvențiere de generația următoare, analiza legării proteinei ADN-ului și a marcajelor epigenetice este utilizată în 1 ChIP asociat cu secvențierea ADN-ului de mare viteză (ChIP-Seq). Cu toate acestea, un protocol standard ChIP-Seq necesită aproximativ 20 de milioane de celule pe reacție, ceea ce face această tehnică dificil de utilizat atunci când celula este limitată, cum ar fi celulele primare izolate și populațiile de celule rare.
Celulele genealogice ale oligodendrocitelor, inclusiv celulele progenitoare ale oligodendrocitelor (OPC) și oligodendrocitele sunt răspândite în tot creierul și sunt esențiale pentru dezvoltarea și funcția creierului. Ca tip de celulă progenitoare, OPC-urile se pot reînnoi și diferenția. OPC nu servesc doar ca progenitori pentru oligodendrocite, ci joacă și un rol important în propagarea semnalizării neuronale prin comunicarea cu alte tipuri de celule cerebrale 2. Studiile anterioare au sugerat că factori de transcripție specifici genului, cum ar fi Olig2 și Sox103, 4, reglementează dezvoltarea oligodendrocitelor. Acești factori de transcripție au fost localizați în regiunile organizatorului sau amplificatorului pentru a lega unele gene cruciale de exprimarea lor, influențând în același timp specificația și diferențierea oligodendrocitelor. Cu toate acestea, este dificil de identificat interesul proteinei (sau complexului proteic) de legare a ADN-ului în OPC primare purificate acut cu un număr foarte limitat de celule.
Acest protocol descrie modul de explorare sistematică a ADN-ului genomic imunoprecipitat de Olig2 în OPC-uri purificate de șoarece la nivel de genom, folosind tehnica ChIP-Seq. OPC-urile creierului șoarecelui au fost purificate acut prin imunopanare și într-un experiment ChIP fără diseminare in vitro. Un număr limitat de OPC poate fi obținut prin imunopan și este suficient pentru experimentele standard ChIP-Seq. Aceasta descrie un protocol ChIP-Seq cu celule scăzute cu 20 mii de celule pe reacție ChIP pentru factorii de transcripție. Pe scurt, celulele reticulate au fost lizate și sonicate de un dispozitiv cu ultrasunete care a forfecat cromatina. Cromatina tăiată a fost incubată cu anticorpi Olig2 și sfere acoperite cu proteina A pentru a precipita ADN genomic legat de anticorp Olig2. După eluarea mărgelelor acoperite cu proteina A și reticularea inversă, ADN-ul genomic a fost precipitat de anticorpi Olig2 și purificat prin extracție cu fenol-cloroform. Produsul rezultat a fost cuantificat și supus cozii T, comutare și extindere a șabloanelor de strălucire, adăugarea de adaptoare și armare, selectarea dimensiunilor bibliotecii și pași de curățare pentru construcția bibliotecii ChIP-Seq.
După secvențiere, calitatea citirilor brute din proba preparată cu anticorpi cu factor de transcripție Olig2 și proba martor a fost analizată. Perechi de baze inferioare și adaptoare cu citirea că fragmentele au fost tăiate. Apoi, citirile tăiate au fost aliniate la genomul de referință al mouse-ului. Regiunile genomice care au fost îmbogățite semnificativ pentru citirile ChIP au fost recunoscute ca vârfuri în comparație cu eșantionul de control. Vârfurile semnificative care reprezintă posibile site-uri de legare a factorului de transcripție au fost filtrate și vizualizate într-un browser de genom.
Metoda descrisă în acest protocol poate fi utilizată în principal pentru ChIP-Seq și în mare parte din alți factori de transcripție cu orice tip de celulă cu numere limitate.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Toate consumul de animale și protocoalele experimentale au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și aprobat de Comitetul instituțional pentru biosecuritate și Comitetul pentru bunăstarea animalelor de la Universitatea din Texas Health Science Center din Houston.
1. Purificarea celulelor liniei oligodendrocitare PDGFRα pozitive din creierul șoarecelui (modificată din protocoalele de imunopanare 5, 6, 7 descrise mai sus)
(2) Pregătirea Low-Cell-ChIP și construcția bibliotecii ChIP pentru secvențierea de mare viteză
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
După evaluarea inițială a controlului calității, citirea și tăierea brute a adaptoarelor și perechile de baze de calitate inferioară sunt reprezentările grafice ale controlului calității din Figura 4afișate. Citirile tăiate trebuie să aibă o calitate de bază mai mare de 30, să nu aibă secvențe de adaptor și să aibă o dublare redusă (Figura 4b-D.). Citirile tăiate de bună calitate măresc rata generală de aliniere. Alți parametri precum conținutul GC sunt, de asemenea, importanți și ar trebui luați în considerare pentru tăiere.
Când se utilizează date ChIP-Seq cu capăt asociat, fragmentele se leagă în jurul factorului de transcripție cu o anumită distanță de separare. Secvențierea la capăt pereche permite o estimare mai precisă a lungimii medii a fragmentelor, rezultând o estimare mai bună a regiunilor genomice în care a avut loc o legare mai mare. Diagrama de corelație a firelor arată o valoare de vârf a îmbogățirii care corespunde lungimii predominante a fragmentului. Ca în Figura 5găsit, lungimea fragmentului calculat este de 130 bp în timp ce citirea durează 50 bp. Un set de date ChIP-Seq în care lungimea fragmentului este mai mare decât citirea indică o calitate înaltă 16 .
În Silico, metodele complementare la experimentul ChIP-Seq sunt analiza îmbogățirii motivelor și căutarea motivelor de novo. Deoarece legarea Olig2 în OPC nu a fost investigată înainte, celulele progenitoare ale motoneuronului și celulele stem embrionare derivate din Olip2 ChIP-Seq au fost utilizate pentru identificarea de novo a motivelor 4, 24. Motivele identificate OLIG2 de Novo au fost adăugate la baza de date cuprinzătoare a motivelor ENCODE 25 și s-a efectuat analiza de îmbogățire a motivelor. Îmbogățirea ridicată a motivelor OLIG2 identificate de novo și a factorului de transcripție cunoscut (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 și ASCL1) au fost găsite în vârfurile ChIP-Seq ale celulelor purificate PDGFRα. O îmbogățire a celor 30 de novo identifică motive cu o valoare E Figura 7 prezintă primele două motive identificate de novo ale Olig2. Aceste două motive Olig2 identificate de novo au fost găsite în celule purificate PDGFRα> 60% recuperate din vârfurile ChIP-Seq în plus față de motivele cunoscute.
Discuţie
După reticularea OPC-urilor purificate, celulele reticulate trebuie spălate cu soluție de HBSS răcită cu gheață și etapele rămase ale ChIP trebuie efectuate la 4 ° C, altfel anticorpul nu poate precipita ADN-ul genomic în mod corespunzător.
Următorul pas important al acestui protocol este pregătirea bibliotecii. Amplificarea PCR a materialului ChIP a fost utilizată pentru construcția bibliotecii. Numărul de cicluri PCR pentru prepararea bibliotecii depinde de cantitatea de ADN. O bună pregătire a bibliotecii necesită cuantificarea exactă a cantității de ADN primit. Prea multe sau prea puține cicluri de PCR pot afecta concentrația bibliotecii, precum și complexitatea care duce la artefacte PCR.
Este dificil să construiți biblioteca ChIP-Seq atunci când aveți un număr limitat de celule de utilizat pentru imunoprecipitare 27. Protocolul standard ChIP utilizat până în prezent necesită 10 ng de preparat de bibliotecă ADN-ChIP-Seq imunoprecipitat 1, 28. Cu toate acestea, protocolul descris aici generează în mod normal 2 ng de ADN imunoprecipitat de către anticorpi Olig2 de la 20.000 OPC. ADN-ul este utilizat pentru a pregăti biblioteca ChIP-Seq printr-o metodă de adaptare într-un singur pas care permite o sensibilitate îmbunătățită permițând amplificarea picogramelor de ADN imunoprecipitat. Combinând kituri comerciale, acest protocol oferă o soluție practică pentru efectuarea ChIP-Seq pentru factorii de transcripție pe baza unui număr mic de celule.
Important, protocolul ChIP-Seq cu celule scăzute descris este aplicabil ChIP-Seq din alți factori de transcripție în celule primare sau populații de celule rare, de asemenea. Anticorpii utilizați în acest protocol trebuie verificați experimental pentru a efectua mai întâi un experiment IP specific. Legarea nespecifică a anticorpilor duce la rezultate slabe. În plus, se recomandă efectuarea acestui experiment cu celule scăzute ChIP-Seq în celule cu o expresie ridicată a factorului de transcriere de interes.
Pentru analiza datelor, poate fi dificil să decideți ce valori să utilizați ca limite după ce ați activat filtrarea de vârf. În funcție de obiectivul analizei, pot fi utilizați parametri mai stricți sau mai relaxați. De obicei, se utilizează o combinație de îmbogățire a compartimentului și valoare p sau FDR. Dacă unele site-uri de legare ale factorului de transcripție au fost cunoscute anterior în studiu, acest lucru poate ajuta la determinarea pragurilor de filtrare. Au fost compilate 29, 30 bazele de date care leagă factorii de transcriere de site-uri web din experimente ChIP-Seq disponibile public în diferite linii și condiții celulare. S-ar putea căuta o genă și să verifice dacă s-au găsit în prealabil site-uri de legare a factorului de transcripție. Cu toate acestea, este important să știm că siturile de legare a factorului de transcripție diferă în funcție de tipurile și condițiile celulare.
În Silico, metodele suplimentare pentru experimentul ChIP-Seq sunt analiza îmbogățirii motivelor și căutarea motivelor de novo cu MEME-ChIP 20 sau programe similare. Căutarea motivelor necesită o bază de date cuprinzătoare cunoscută și derivată de novo a motivelor z. B. Codificați motivele 25 sau baza de date Hocomoco 31. Hocomoco este o bază de date cu motive descoperite din experimente ChIP-Seq accesibile la public și la șoarece. Dacă motivele pentru proteina presupusă sunt necunoscute, căutarea de novo a motivelor ar putea dezvălui tipare repetitive de secvențe într-o proporție semnificativă a vârfurilor ca motive noi. Opțiunile combinatorii pentru acțiunea factorilor de transcripție pot fi prezentate dacă se găsesc și motive din alți factori de transcripție, îmbogățiți în vârfurile rezultate.
Regiunile de vârf îmbogățite pot fi validate experimental folosind cromatina celulelor mutate sau knock-out ca martori. Efectuarea ChIP-Seq cu celule care nu exprimă factorul de transcripție sunt utilizate pentru a identifica vârfuri fals pozitive, denumite și „vârfuri fantomă” 32. Rezultatele pozitive false sunt filtrate.
De asemenea, este interesant să comparați vârfurile ChIP-Seq rezultate cu datele transcriptomice. Vârfurile PDGFRα-Olig2 ChIP-Seq au fost comparate cu expresia genelor în OPC dintr-o publicație anterioară 18. Această strategie poate fi limitată, deoarece mecanismele care leagă genele exprimate în OPC, deoarece factorul de transcripție Olig2 poate fi controlat. În plus, factorul de transcripție Olig2 poate lega o regiune de reglare a genei, dar gena poate avea niveluri scăzute de exprimare a genei datorită posibilelor mecanisme inhibitorii sau lipsei co-factorilor necesari pentru transcrierea genei.
ChIP-Seq este o metodă utilizată pentru a identifica site-urile de legare a ADN-ului la nivelul genomului pentru factorii de transcripție și alte proteine. Cu toate acestea, analizând apariția simultană a factorilor de transcripție, cercetătorii au descoperit că factorii de transcripție tind să se asocieze cu alte proteine care formează Co Modulul 33. Acest lucru înseamnă că unele legături între factorii transcripționali și ADN-ul genomic dezvăluit de ChIP-Seq sunt indirecte și acoperite de alte proteine. Prin urmare, pentru rezultate mai semnificative, cercetătorii ar trebui să studieze factorul de transcripție multiplă în același timp.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Dezvăluiri
Autorii afirmă că nu au conflicte de interese financiare.