Inducerea plăcilor aterosclerotice prin activarea receptorilor mineralocorticoizi în
rezumat
Descriem un protocol pentru inducerea aterosclerozei în rădăcinile aortice ale șoarecilor ApoE -/- hrăniți cu o dietă aterogenă printr-o eliberare continuă de aldosteron. Sunt de asemenea descrise metode pentru caracterizarea compoziției plăcii.
Abstract
Introducere
Mai multe studii au arătat că aldosteronul este implicat în dezvoltarea aterosclerozei 8, 9, 10. Infuzia de aldosteron la șoarecii ApoE -/- hrăniți cu o dietă aterogenă accelerează dezvoltarea leziunilor aterosclerotice inducând rădăcina aortică inflamată și formarea plăcii bogate în lipide- 10 .
Pe scurt, descriem un protocol care include perfuzie de aldosteron, hrănirea dietetică aterogenă, încorporarea țesutului cardiac, cuantificarea și caracterizarea leziunilor aterosclerotice la șoarecii ApoE -/-. Această procedură promovează formarea eficientă a plăcilor aterosclerotice inflamate, bogate în lipide și oferă un model valoros pentru studiul aterogenezei.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Studiul a fost finanțat de Comitetul Institutului Național Italian de Sănătate și Utilizare, Autorizația nr. 493/2016-PR. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu orientările Comunității Europene pentru utilizarea animalelor de laborator (orientarea UE 2010/63/UE).
Notă: Implantarea subcutanată a minipompei osmotice cu vehicul (etanol în soluție salină) sau aldosteron (240 µg · kg -1 · d -1) la șoareci masculi de 8-10 săptămâni neadecvate pentru gena ApoE. În general, șoarecii masculi ApoE -/- în vârstă de 8-10 săptămâni cântăresc aproximativ 25-26 g.
- Se dizolvă 5 mg pulbere de aldosteron în 1 ml etanol absolut.
- 68,3 uL soluție salină Adăugați 56,7 uL aldosteron (dizolvat în etanol) pentru a obține o concentrație de 2,27 µg/µL. umpleți întreaga minipompă osmotică complet cu 125 µL din această soluție (capacitatea maximă a fiecărei minipompe este de 125 µL).
- Utilizați un debit minipump de 0,11 µL/h; Prin urmare, 2,64 µL de soluție eliberată la fiecare 24 de ore. Dați fiecărui șoarece aproximativ 6 µg · d -1 de aldosteron timp de 28 de zile.
(2) umplerea și implantarea pompei osmotice
Notă: Pompele vin în două părți separate: partea principală a pompei și regulatorul de debit.
3. disecția inimii
4. Tăiați secțiuni din rădăcina aortică
NOTĂ: Toate etapele de colorare raportate în următoarele protocoale sunt efectuate în cuve de colorare a sticlei Coplin.
(6) Analiza imaginii a leziunilor aterosclerotice în secțiunile rădăcinii aortice
Notă: secțiunile rădăcinii aortice colorate cu Oil Red O sau MAC3 sau cu un anticorp de interes pot fi procesate folosind software-ul adecvat (informații în Tabelul materialelor) de analizat. Colorarea totală a pixelilor pozitivă pentru componenta de interes este normalizată la aria totală a plăcii. Imaginile au fost colectate și analizate de un investigator orbit de tratament.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
În 8-10 săptămâni, șoarecii Apo -/- au fost implantați pentru perfuzie cu vehicul sau aldosteron (Fig. 1E-1I) și a hrănit o dietă aterogenă (dietă cu calorii ajustate 42% din grăsimi) timp de 4 săptămâni. La sfârșitul tratamentului, șoarecii au fost eutanasiați și perfuzați cu PBS cu 10% formalină așa cum s-a descris mai sus. Rădăcina aortică s-a separat de partea apicală a inimii și a fost încorporată în OAT (Figura 2). Secțiunile transversale ale rădăcinilor aortice au fost pregătite pentru diferite colorări cu ajutorul unui aparat de criostat (Figura 3).
Compoziția aterosclerotică a plăcii poate fi caracterizată prin colorarea anumitor componente care definesc stadiul de dezvoltare a plăcii. Colorarea cu ulei roșu O este utilizată pentru a determina conținutul de grăsime al leziunilor aterosclerotice așa cum este descris în pasul 5.1, colorarea cu roșu Picro Sirius este utilizată pentru a determina conținutul de colagen așa cum este descris în pasul 5.2 și colorarea Mac3 este utilizată pentru a măsura conținutul de macrofage descris în pasul 5.1. 5.3. După 4 săptămâni de tratament cu șoareci aldosteron, s-a înregistrat o creștere semnificativă a lipidelor (Figura 4A-4 C) și conținutul de macrofage (Figura 4-4F) afișate în plăci aterosclerotice la nivelul rădăcinii aortice, dar nu au fost observate diferențe în conținutul de colagen (Fig. 4-4I) în comparație cu șoarecii tratați cu vehiculul. Într-adevăr, în acest model, aldosteronul accelerează aterogeneza, inducând inflamație vasculară, dar nu și fibroză (Figura 4).
Ilustrația 1: Pregătirea și implantarea minipompei osmotice cu vehicul sau aldosteron. DIN) Pași pentru umplerea mini-pompelor osmotice cu vehicul sau aldosteron. C) Pași pentru închiderea corpului pompei cu regulatorul de debit. D-F) Pași pentru a crea o incizie pentru implantarea pompei pe spatele mouse-ului. G-eu) Implantarea minipompei osmotice și coaserea inciziei. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.
Figura 2: Pregătiți-vă să încorporați și să tăiați inima și rădăcina aortică. DIN) inima este tăiată transversal de-a lungul unei linii drepte care leagă punctele inferioare ale atriurilor din dreapta și stânga. Partea apicală a inimii este procesată pentru a cuantifica compoziția leziunii aterosclerotice în rădăcina aortică. C) rădăcina aortică din interiorul inimii. D-E) Cavitatea inimii este umplută cu Oct. F) Orientarea inimii într-o matriță disecată preumplută cu OCT (cu cavitatea inimii spre fundul matriței) G) Congelarea inimii disecate cu OCT în matriță. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
Ateroscleroza este o boală inflamatorie cronică care afectează vasele mari și mijlocii cu interacțiuni între mai multe tipuri de celule, cum ar fi B. Macrofagele, limfocitele T, celulele endoteliale și celulele musculare netede sunt atribuite celulelor 1. În ciuda limitărilor modelelor aterogene murine, există un mare număr de dovezi privind procesul aterosclerotic. Aceste modele au avantajul de a genera rapid cohorte experimentale de o anumită vârstă și sex. Șoarecii prezintă, de asemenea, un fundal genetic definit și omogen.
Dezvoltarea plăcilor aterosclerotice, observată la modelele de șoareci predispuse la arterioscleroză, amintește parțial de subiecți, cu excepția formării instabile a plăcilor 4 observate. Ruptura plăcii și tromboza ulterioară, principala cauză a infarctului miocardic la om, nu au fost observate la modelele aterogene murine. În publicațiile noastre am arătat că infuzia de aldosteron pentru a induce un fenotip instabil de placă la șoarecii ApoE -/- hrăniți cu HFD-10 după 4 săptămâni. De fapt, acest tratament poate crește placa, conținutul de grăsimi și nivelul zonei inflamatorii ale rădăcinii aortice, fără nicio diferență semnificativă în comparație cu conținutul de colagen de șoareci netratați. Rețineți, acești șoareci prezintă o dezvoltare crescută a aterosclerozei independente de hipertensiune, având în vedere că tratamentul cu aldosteron 10 tensiunea arterială nu a fost modificat semnificativ.
În prezentul manuscris prezentăm în detaliu procedura tehnică pentru încorporarea țesutului cardiac în octombrie, precum și etapele succesive, adică H. Tăiați rădăcina aortică și analizați placa. Comparativ cu parafina, OCT permite prepararea secțiunii cu o gamă mare de grosime (1-100 µm) cu un microtom criostatic și o prelucrare minimă a țesuturilor. Limitările pot afecta, de asemenea, calitatea țesutului înghețat, care afectează potențial formarea cristalelor de gheață și modifică detaliile subcelulare și produce artefacte detectabile prin colorare imunohistologică. De fapt, crioconservarea se crede că păstrează mai bine antigenul și antigenicitatea. De fapt, țesutul înghețat păstrează structura antigenelor. Prelucrarea țesuturilor congelate pentru imunohistochimie permite, de asemenea, evitarea utilizării formalinei, care este o substanță toxică și cancerigenă, pentru a fi evitată.
Observație Când apar cele trei supape, cel mai bine este să tăiați țesutul la grosimi diferite, în funcție de tipul de analiză care se efectuează. De fapt, unele diapozitive sunt utilizate pentru a determina progresia plăcii, în timp ce diapozitivele rămase ar putea fi utilizate pentru diferite pete (de exemplu, Picro Sirius, Mac3 etc.).
Leziunile aterosclerotice la șoarecii tratați cu aldosteron apar bogate în lipide, iar macrofagele se caracterizează prin utilizarea de ulei roșu O (pentru colorarea lipidelor), Mac3 (pentru colorarea macrofagelor), roșu Sirius (pentru colorarea colagenului) sau alți anticorpi specifici de interes Proteine. Este important de subliniat faptul că încorporarea OCT, spre deosebire de încorporarea parafinei, evită utilizarea solvenților organici care îndepărtează conținutul de lipide al leziunilor. Prin urmare, colorarea lipidelor cu ulei roșu O este fezabilă în secțiunile încorporate în OCT și conținutul de grăsime al plăcilor aterosclerotice poate fi cuantificat cu precizie.
În prezentul manuscris, am arătat că infuzia de aldosteron este o metodă valoroasă pentru promovarea aterosclerozei la șoarecii ApoE -/-. Conform, infuzia de aldosteron la șoarecii ApoE -/- este capabilă să: 1) mărească activarea celulelor endoteliale, reprezentată de expresia crescută a moleculelor implicate în aderența și migrarea monocitelor în stadiile incipiente ale formării plăcii aterosclerotice 12, 13; și 2) conținut de lipide și macrofage pro-inflamatorii pentru a crește stadiul de rădăcină aortică 10, 13. Aceste efecte nu se datorează efectelor hemodinamice ale aldosteronului 10. Pe scurt, protocolul propus oferă o metodă validă pentru a genera și caracteriza ateroscleroza la șoareci; Acest lucru ar putea monitoriza stadiile incipiente ale bolii și rezultatele intervenției terapeutice și reabilitării în ateroscleroză.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.