Influența hemoxigenazei inductibile (HO-1) asupra microcirculației în
De la Departamentul Clinicii de Chirurgie Universitară Chirurgie Generală și Viscerală de la Universitatea Albert Ludwig din Freiburg i.br. Influența hemoxigenazei inductibile (HO-1) asupra microcirculației în pancreatita post-ischemică I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N pentru obținerea diplomei de medic medical de la Facultatea de Medicină a Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Prezentat în 2006 de Moritz Scholtes născut în Aachen
2 Decan: Prof. Dr. med. C. Peters 1 recenzor: PD Dr. med. O. Thomusch Recenzorul 2: Prof. Dr. med. B. Defalcări Anul absolvirii: 2007
4 Această lucrare a fost supravegheată de Dr. med. E. von Dobschütz
5 CUPRINS 1. INTRODUCERE. 7 1.1 PANCREATITA ACUTĂ. 7 1.2 MICROCIRCULAȚIE. 8 1.3 REPERFUZIA ISCHEMIEI. 9 1.4 HEMDEGRADARE DATORIE DE HEMOXIGENAZĂ. 11 1.4.1 Reacția hemoxigenazei și a produselor sale. 12 1.4.1.1 Fier. 13 1.4.1.2 CO. 13 1.4.1.3 Biliverdină și bilirubină. 13 1.4.2 Izoenzime HO: structură, distribuție, reglare. 14 2. SCOPUL STUDIULUI. 17 3. MATERIAL ȘI METODE. 18 3.1 OBSERVAȚIE PRELIMINARĂ. 18 3.2 MODEL EXPERIMENTAL. 18 3.2.1 Animale experimentale. 18 3.2.2 Pretratare și medicamente. 18 3.2.3 Anestezie și ventilație. 19 3.2.4 Tehnologia microchirurgicală. 20 3.3 METODE DE EXAMEN. 23 3.3.1 Macrohemodinamica. 23 3.3.2 Microhemodinamica. 23 3.3.2.1 Densitatea capilară funcțională. 24 3.3.2.2 Interacțiunea leucocit-endotelial. 25 3.3.3 Parametrii de laborator. 26 3.3.4 Determinarea HO-1. 26 3.3.4.1 Dovada activității. 27 3.3.4.2 Analiza Northern blot. 29 3.3.4.3 Analiza Western blot. 31 3.4 PROTOCOLUL EXPERIMENTAL. 32 3.4.1 Grupuri de testare. 32 3.4.2 Procedura de testare. 32 3.4.2.1 Condiții de control. 32 3.4.2.2 Pancreatita de ischemie-reperfuzie. 33 3.4.2.3 Inducerea hemoxigenazei 1. 34 3.4.2.4 Inhibarea activității hemoxigenazei. 35 3.5 STATISTICI. 35
6 4. REZULTATE. 36 4.1 MACROHAEMODINAMICĂ. 36 4.2 MICROHAEMODINAMICĂ. 38 4.2.1 Densitatea capilară funcțională. 38 4.2.2 Interacțiunea leucocit-endotelial. 41 4.3 PARAMETRI DE LABORATOR. 44 4.4 DETECTAREA HEMOXIGENAZEI. 45 4.4.1 Dovada activității. 45 4.4.2 Northern blot. 46 4.4.3 Western blot. 47 4.5 PREZENTARE GENERALĂ. 47 5. DISCUȚIE. 48 5.1 DISCUȚIA METODOLOGIEI. 48 5.1.1 Pancreatită acută experimentală. 48 5.1.2 Parametri măsurați. 51 5.1.2.1 Cuantificarea microhemodinamicii. 51 5.1.2.2 Cuantificarea interacțiunii leucocite-endoteliale. 53 5.1.2.3 Dovada activității. 55 5.1.2.4 Northern blot. 56 5.1.2.5 Western blot. 57 5.2 DISCUȚIA REZULTATELOR. 58 5.2.1 Influența ischemiei și reperfuziei. 58 5.2.1.1 Hemodinamica macro. 58 5.2.1.2 Microhemodinamica. 58 5.2.1.3 Interacțiunea leucocit-endotelial. 62 5.2.1.4 Expresia și activitatea hemogenezei. 63 5.2.2 Influența HO-1. 65 5.2.2.1 Macrohemodinamica. 66 5.2.2.2 Microhemodinamica. 66 5.2.2.3 Interacțiunea leucocit-endotelial. 69 5.2.2.4 Exprimarea și activitatea hemoxigenazei. 71 6. REZUMAT. 72 7. LISTA LITERATURII. 73 8. LISTA FIGURILOR ȘI TABELELOR. 92 9. LISTA ABREVIERILOR. 95 10. MULȚUMIRI. 96 11. CURRICULUM VITAE. 98
10 Aceste mecanisme duc la o tulburare de microcirculație, care la rândul său duce la o reducere a alimentării cu energie a țesutului și astfel menține cercul vicios (Figura 1). Na + -K + - ATPaza Na + -Ca 2+ - Antiport ATP Na + Ca 2+ Proteaze XDh O 2 Hyx + XOx Ischemia Sânge-O 2 Reperfuzie O 2 -permeabilitate radicală Edem Tromboză Coagularea leucocitelor Degradarea ECM Afectarea membranei Tulburarea microcirculației Activarea leucocitelor Deteriorarea celulelor Deteriorarea endotelială Enzime Citokine Figura 1: Cercul vicios de ischemie-reperfuzie daune: Procesele din ischemie (deasupra) provoacă leziuni celulelor în reperfuzie (dedesubt), ceea ce duce la deteriorarea hipoxică a țesutului.
17 2. SCOPUL STUDIULUI Scopul prezentului studiu experimental a fost de a investiga efectul ischemiei de o oră și al reperfuziei de două ore asupra microcirculației pancreasului. S-a examinat dacă și cum se schimbă condițiile în timp. Mai mult, ar trebui să se stabilească dacă și în ce mod inducția exogenă a hem oxigenazei inductibile (HO-1) influențează aceste condiții. În special, au fost examinate densitatea capilară funcțională ca parametru al situației de aprovizionare nutrițională în reperfuzie și interacțiunea leucocită-endotelial ca parametru pentru reacția inflamatorie timpurie. Pentru determinarea acestor parametri s-a folosit metoda de microscopie epifluorescentă intravitală. Influența hemoxigenazei în exprimarea și activitatea sa a fost verificată de biologia moleculară. Lucrarea este împărțită în următoarele secțiuni: 1. Efectele ischemiei și reperfuziei asupra microcirculației pancreasului fără influență exogenă asupra hem oxigenazei 2. Efectele inducției hem oxigenazei asupra microcirculației pancreasului în pancreatita post-ischemică
22 Figura 5: Traseul schematic al vaselor din arterele pancreatice (de la HOFFMANN 70)