Influența stresului prenatal asupra mielinizării și formării rețelei neuronale
Influența stresului prenatal asupra mielinizării și formării rețelei neuronale în creierul ovinului fetal Disertație pentru obținerea diplomei universitare doctor medicinae (Dr. med) prezentată Consiliului Facultății de Medicină a Universității Friedrich Schiller Jena de Julia Quendt născută pe 5 septembrie 1987 în Gotha
Recenzent: 1. Prof. Dr. med. Matthias Schwab/Jena 2. Prof. Dr. med. Richard Berger/Neuwied 3. PD Dr. med. Ziua apărării publice Bernd Romeike/Jena: 6 mai 2014
Cuprins Cuprins LISTA ABREVIERILOR I 1 REZUMAT 1 2 INTRODUCERE 3 2.1 Semnificația clinică a stresului prenatal pentru făt 3 2.2 Dezvoltarea creierului fetal 5 2.2.1 Dezvoltarea creierului embrionar 5 2.2.2 Proliferarea și migrația celulară 5 2.2.3 Diferențierea neuronală și glială 6 2.2.4 Mielinizarea cerebrală 7 2.2.4.1 Structura și compoziția biochimică a tecii de mielină 7 2.2.4.2 Funcția și semnificația tecii de mielină 9 2.2.4.3 Originea și diferențierea oligodendrocitelor 10 2.2.4.4 Cursul de timp al mielinizării 11 2.3 Efectele stresului prenatal asupra dezvoltării creierului fetal 13 2.3.1 Efectele cerebrale ale stresului matern 13 2.3.2 Efectele cerebrale ale terapiei prenatale cu glucocorticoizi 14 2.3.3 Reglarea axei stresului 16 2.3.4 Efectele stresului matern și ale terapiei prenatale cu glucocorticoizi asupra dezvoltării axei stresului 18 2.4 Mecanismele efectelor stresului prenatal 19 2.4.1 Transmiterea maternei Stresul asupra făturilor 19 2.4.2 Efectele mediate de receptor ale glucocorticoizilor 20 2.4.3 Stresul prenatal și hormonii de creștere 21 2.5 Obiectivul activității 22
Cuprins 3 MATERIAL ȘI METODE 25 3.1 Experiment 25 3.1.1 Protocol experimental 25 3.1.2 Obținerea creierului fetal și producerea specimenelor 27 3.2 Colorare histochimică și imunohistochimică 28 3.2.1 Colorare generală cu hematoxilin-eozină 28 3.2.2 Impregnare cu argint conform Bielschowsky 29 3.2.3 Detectarea imunohistochimică a MBP 31 3.3 Evaluarea microscopică ușoară și asistată de PC 35 3.4 Evaluarea statistică 39 4 REZULTATE 40 4.1 Greutatea corporală și greutatea creierului după stresul prenatal 40 4.2 Efectele cerebrale ale stresului prenatal 42 4.2.1 Formarea proceselor neuronale în substanța albă 42 4.2.1.1 Substanță albă subcorticală 42 4.2.1.2 Corp calos 47 4.2.1.3 Substanță albă profundă coroană radiată 49 4.2.1.4 Capsulă internă 51 4.2.2 Mielinizarea proceselor neuronale în substanța albă 53 4.2.2.1 Substanță albă subcorticală 53 4.2.2.2 Corpus calosum 58 4.2.2.3 Substanță albă profundă - Corona radiata 60 4.2.2.4 Capsula interna 62 4.2.3 Form Formarea structurilor neuronale în hipocamp (regiunea CA3) 64
Cuprins 5 DISCUȚIE 69 5.1 Discutarea metodelor 69 5.1.1 Modelul animal 69 5.1.2 Modelul stresului 70 5.1.3 Histologie 72 5.1.4 Analiza cantitativă a imaginii 74 5.2 Discuția rezultatelor 75 5.2.1 Stresul prenatal și creșterea fetală 75 5.2.2 Efectele stresului prenatal asupra hipocampului 78 5.2.3 Efecte cerebrale după stres prenatal asupra rețelei neuronale 79 5.2.4 Efecte cerebrale după stres prenatal asupra mielinizării 82 6 CONCLUZII 84 7 LITERATURĂ ȘI REFERINȚE 86 8 ANEXĂ 102 8.1 Mulțumiri 102 8.2 Declarație de onoare 103
Lista abrevierilor Lista abrevierilor ABC ACTH ADHD AK AP AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) crh GR GT HE HHN ax 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Avidin-Biotin-Complex Hormon adrenocorticotropic Deficiență de atenție/hiperactivitate tampon de lucru Anticorp tampon de lucru + tampon de lucru Triton-X-100 + Triton + Ser Aqua distillata (apă distilată) arginină-vasopresină betametazonă 2-3 -Nucleotidă ciclică 3-fosfohidrolază (placentară) hormon de eliberare a corticotropinei receptor glucocorticoid gestație zi (zile) hematoxilină-eozină hipotalamică-hipofizară axa a XI-a Hidroxisteroid dehidrogenază tip 2 Insulină asemănătoare factorului de creștere Glicoproteină asociată cu mielina Proteină de bază mielină Mielină/oligodendrocit glicoproteină Receptor mineralocorticoid Valoare medie Oligodendrocit proteină mielină tampon fosfat Proteină proteolipidică Mișcarea rapidă a ochilor Temperatura camerei Eroarea standard a valorii medii
2 Inducerea leucomalaciei perventriculare (leziuni ale substanței albe în timpul nașterii premature) în jurul timpului 0,65 de gestație (corespunzător săptămânii 24-28 de gestație la fătul uman), un grad ridicat de comparabilitate a dezvoltării creierului între ovine fetale și oameni. Acest lucru a fost susținut de faptul că în această fereastră de timp începe maturarea oligodendrocitelor din creierul fetal al oilor și, în același timp, se poate observa un risc ridicat de afectare a substanței albe imature, periventriculare, la sugarii prematuri (Back și colab. 2006, 2001) . La momentul nașterii, creierul persoanei create prezintă un grad de maturitate ceva mai mare decât cel al oamenilor (McIntosh și colab. 1979, Astrom 1967). Acest lucru ar putea sugera că mintea creativă se maturizează mai repede în ultimul trimestru. Al 12-lea
2 Introducere răspuns fiziologic coordonat la diferite concentrații de cortizol (capitolul 2.4.2). Fig.2.3: Axa hipotalamus-hipofizo-suprarenală și căi de feedback negativ. Hormonul de eliberare a corticotropinei (CRH), vasopresina argininei (AVP), proopiomelanocortina (POMC), hormonul adrenocorticotropic (ACTH), nucleul paraventricular (NPV). Modificat din Metthews 2002. 17
2 Introducere arată un curs temporal al dezvoltării creierului similar cu cel al oamenilor, chiar dacă acesta se maturizează puțin mai repede. În total, au fost evaluate creierele a 45 de lucrători care au fost stresați cronic între gestația 0,20-0,66 (30th-100th GT) prin izolarea de 180 de minute în două zile pe săptămână. Deoarece oile sunt animale de turmă, izolarea este un factor de stres major pentru această specie. Pentru a arăta posibilele efecte de durată, creierele au fost evaluate la 0,73 (110 GT, durata gestației 150 zile) și 0,86 de gestație (130th GT). Rezultatele sunt menite să ajute la clarificarea efectelor stresului prenatal asupra funcției creierului în viața ulterioară. 24
3 Materiale și metode Izolate la urechea altor animale, astfel încât la sfârșitul protocolului fiecare animal a fost expus la izolare individuală de 20 de ori. Deoarece oile sunt animale de turmă, ele sunt deosebit de sensibile la acest factor de stres. Măsurătorile nivelului de cortizol înainte și în timpul izolării au confirmat acest efect (Rakers și colab. 2012). Grup de stres Grup de control Sincronizarea ciclului estru și împerecherea programată ÎN COMPARAȚIE Creșterea animalelor adecvate la cioban Transportul animalelor însărcinate la un laborator de test Stres prin izolare de 2 ori pe săptămână timp de 3 ore Instrumentație cronică Obținerea creierelor fetale - Grupa 1 Obținerea creierelor fetale - Grupa 2 Data limită naturală Fig .3.1: Protocol experimental Între 100 și 110 GT, făturile au fost instrumentate folosind catetere, care au fost utilizate pentru a verifica răspunsurile la stres intrauterin (ACTH și eliberarea de cortizol). Evaluarea lor nu face obiectul acestei lucrări (vezi Rakers 2012). După finalizarea experimentelor și dezvoltarea operativă a făturilor, au fost determinate greutățile corpului și creierului lor. Aceste măsurători au fost luate pe 26
3 Material și metode ale unei serii alcoolice ascendente deshidratate și incluse într-un mediu de montare Neo-Mount (MERCK GmbH, Darmstadt, Germania). Protocolul detaliat al colorării este prezentat în Tabelul 3.2. Depilare medie: 2x Neoclear 2x izopropanol 100% 1x izopropanol 80% 1x izopropanol 50% apă distilată. Impregnare cu argint: AgNO 3 20% 2x aqua dest. Soluție amoniacală de azotat de argint apă distilată + nh 3 (4: 1) Tiosulfat de apă de la robinet 5% apă distilată. Deshidratare: Isopropanol 50% Isopropanol 80% 2x Isopropanol 100% 2x Includere balsam neocleară cu timp Entellan [min]/Temp. [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90/37 30/45 1- 3/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Tabelul 3.2: Protocol pentru impregnarea argintului conform Bielschowsky. RT temperatura camerei. Soluțiile se prepară după cum urmează: soluție de azotat de argint 20% (AgNO3): 100 ml apă distilată. + 20 g azotat de argint 5% tiosulfat de sodiu (Na 2 S 2 O 3): 100 ml apă distilată. + 5 g tiosulfat de sodiu Preparat pentru soluția de dezvoltare: 25 ml apă distilată. + 125 mg acid citric (Fluka Chemie, Buchs, Germania) + 5 ml 36% formalină (Carl ROTH GmbH, Karlsruhe, Germania) + 8 µl acid azotic concentrat-ENT 3 (Fluka Chemie, Buchs, Germania). 30
3 Material și metode 2xAP + T Complex ABC: soluție AP + T + soluție A + soluție B + T 2x apă distilată PBS. 3'3-diaminobenzidină (DAB) 2x dest. Acv. Deshidratare: izopropanol 50% izopropanol 80% 2x izopropanol 100% 2x Neoclear 100% incluziune balsamică cu Entellan 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT 20µl fiecare din soluția A și B în 1 ml AP + T 1Set (H2O2 + DAB) pentru 5 ml apă distilată, filtru cu filtru Millipore Tabel 3.3: Protocol pentru detectarea imunohistiochimică a MBP. Soluțiile se prepară după cum urmează: Citrat tampon: 1 litru apă distilată. + 2,94 g citrat de sodiu (Fluka Chemie, Buchs, Germania), pH 6,0. PBS: 1 litru de apă distilată. + 1 g tampon de lucru D-PBS: 500 ml PBS + 2,5 g albumină serică bovină (albumină din ser bovin, minim 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Germania) + 250 µl TWEEN 20 (polioxietilen sorbitan monolaurat) (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Germania) ph 7.5. Soluție DAB (substrat Sigma Fast DAB): 2 tablete (peroxid de hidrogen de uree și 3,3-diaminobenzidină) în 5 ml apă distilată. rotiți până când comprimatele finite se dizolvă complet. 34
3 Material și metode Figura 3.3: Colorarea generală a HE modificată, conform The Sheep Brain Atlas, Michigan State Unversity Brain Biodiversity Bank, National Science Foundation. https://www.msu.edu/
creier/creier/oaie/index.html, 15.02.2012. Stânga: Substanță albă subcorticală în cortexul frontal: lângă cortex [1] și departe de cortex [2]; Corpus calos [3]; Corona radiata [4]; Capsulă internă [5]; SV: ventricul lateral. Dreapta: regiunea CA3 în hipocamp: secțiune ventrală [1], secțiune dorsală [2] 36
3 Material și metode După stocarea digitală, înregistrările au fost evaluate într-un program de procesare a imaginilor (Scion Image 1.62 NIH, SUA). În primul rând, imaginile color au fost convertite în imagini alb-negru cu 256 de niveluri de gri. Zona marcajului pozitiv într-o secțiune reprezentativă a fost determinată prin intermediul analizei imaginii. Aria imunomarcării/impregnării cu argint reflectă distribuția imunohistochimică a antigenului/densității proceselor celulare. În comparație cu imaginea microscopică, o valoare prag superioară și inferioară au fost stabilite sub control vizual. Aceste valori prag formează un interval pentru o reprezentare selectivă a imunoreactivității MBP pozitive sau a fibrelor nervoase de culoare argintie. (vezi Fig. 3.4, marcaj roșu). Fig.3.4: Analiza imaginii cu ajutorul valorilor de gri A: Imagine microscopică: Procese neuronale în substanța albă subcorticală a cortexului frontal îndepărtat de cortex. 37
3 Material și metode B: Marcarea extensiilor celulelor colorate în imaginea în tonuri de gri Comparativ cu imaginea microscopică, o imagine gri este definită în imaginea în tonuri de gri (marcată cu roșu în imagine), care corespunde semnalului pozitiv al impregnării de argint. Această zonă este măsurată de programul de analiză a imaginii. 38