Izolarea ARN - biologie

Cât de fierbinte este prea fierbinte pentru viața adâncă sub fundul oceanului?

Antibiotice din bacterii

Migrația celulară: funcția nou descoperită a unei proteine ​​cunoscute

Busolă moleculară pentru alinierea celulelor

Ceea ce face ca frunzele să îmbătrânească toamna

Democrația bibilicilor vultur

Mediul lui Ekembo: Oamenii au trăit și în peisaje deschise

| Genetica | Agricultură, silvicultură și creșterea animalelor

Soiul de grâu a fost creat prin traversarea ierburilor sălbatice

Cât de fierbinte este prea fierbinte pentru viața adâncă sub fundul oceanului?

Izolarea ARN-ului

Izolarea ARN-ului din celule permite o analiză a activității celulare actuale la un anumit moment în timp, deoarece doar genele care sunt în prezent transcrise în celulă sunt prezente ca ARN în momentul izolării. Astfel, izolarea ARN este o tehnică importantă în biologia moleculară, iar ARN-ul izolat poate fi utilizat în numeroase metode de analiză a expresiei genice.

Caracteristici speciale la manipularea ARN-ului

RNazele (enzime care catalizează divizarea ARN-ului în fragmente mai mici) au o stabilitate ridicată și pot fi încă active după autoclavare. ARN-ul este foarte susceptibil de degradare de către ARNazele, a căror sarcină naturală este hidroliza independentă de Mg 2+ a legăturilor fosfodiester în coloana vertebrală a fosfatului ARN-ului. Prin urmare, manipularea ARN necesită mai multă grijă decât lucrul cu ADN-ul mult mai stabil. Pentru a evita degradarea ARN-ului, ARN-urile și ARN-urile trebuie separate între ele într-un stadiu incipient și trebuie prevenită introducerea ARN-urilor din mediu în probă. Prin urmare, trebuie purtate mănuși de unică folosință, deoarece RNazele sunt produse de toate organismele și, prin urmare, sunt prezente și pe suprafața pielii în transpirația umană. În plus, este logic să folosiți un anumit set de consumabile (pipete, cutii de pipete etc.) numai pentru experimentele cu ARN. În plus, ar trebui utilizată apă specială fără RNază.

Izolarea ARN-ului

După cum sa menționat deja, atunci când se izolează ARN-ul este foarte important să separați ARNazele de ARN cât mai devreme posibil. Toate metodele de izolare a ARN se bazează pe lizarea celulelor într-un mediu chimic în care ARNazele sunt denaturate rapid. ARN-ul este apoi separat de celelalte componente celulare. În acest fel, se obține ARN total. Acest ARN total poate fi utilizat direct pentru alte experimente (de exemplu, Northern blot, transcriere inversă în ADNc), sau poate fi utilizat ca substanță de pornire pentru izolarea ARNm.

ARN-ul este

Metodă conform lui Chomczynski și Sacchi

Această metodă utilizează un reactiv special (de exemplu, TRIzol Reagent ® de la Invitrogen sau TriFast ™ de la peqLab). Acest lucru face posibilă obținerea de ARN din celule sau țesut conform unui protocol specific. Această procedură se bazează pe așa-numitul "Un singur pas" Metoda Chomczynski și Sacchi. Trizolul conține tiocianat de guanidiniu, care lizează celulele și, în același timp, inactivează RNaze și alte enzime. Reactivul conține și fenol, în care ADN-ul și proteinele se dizolvă. Fazele sunt separate prin adăugarea de cloroform și apoi centrifugare. Apoi, pot fi recunoscute trei faze. Faza apoasă superioară conține ARN, ADN interfazic și proteine ​​de fază cloroform inferioară. ARN-ul în faza apoasă este apoi precipitat cu izopropanol sau etanol. După două etape de spălare, ARN-ul se află, de ex. Apă fără RNase și este disponibilă pentru alte aplicații.

Metoda "Nonidet P-40"

Această metodă nu este potrivită pentru țesut și este utilizată pentru a obține ARNm din citosol. Avantajul acestei metode este că nucleele celulare rămân intacte și, prin urmare, există și posibilitatea izolării ADN-ului. Principiul se bazează pe detergentul nonionic Nonidet P-40, care se adaugă celulelor și ADN-ul (nucleii celulelor) se așează sub formă de pelete după centrifugare. ARN-ul, proteinele și resturile celulare rămân în soluție. Apoi urmează ca la "Un singur pas" Metoda de izolare cu fenol/cloroform.

Kit sisteme

Ca o opțiune suplimentară pentru izolarea ARN-ului, există multe sisteme de kit-uri de la diverse companii și în numeroase modele disponibile (de exemplu, RNeasy Mini Kit ® de la Qiagen). Aceste sisteme de kit folosesc coloane mici care leagă în mod specific ARN-ul.

Determinarea concentrației prin spectrofotometrie

La determinarea concentrației prin spectrofotometrie, densitatea optică este măsurată la λ = 260 nm (OD260), absorbția maximă a acizilor nucleici (ADN, ARN) și la λ = 280 nm (OD280), absorbția maximă a proteinelor. Dacă proba este contaminată cu ADN genomic sau proteine, se poate determina din coeficientul OD260 și OD280. Pentru ARN pur, raportul ar trebui să fie de aproximativ 2,0. Dacă valoarea este mai mică decât aceasta, proba este contaminată cu proteine, ADN genomic și/sau substanțe aromatice. În acest caz, ARN-ul trebuie purificat din nou. Deoarece un OD260 de 1 corespunde cu 40 µg/ml ARN, concentrația ARN poate fi calculată folosind următoarea formulă:

Concentrație [µg/ml] = OD260 × 40 µg/ml × factor de diluare