Măsurarea lipolizei bazale și stimulate de forskolin în protocolul tampoanelor de grăsime inghinală

rezumat

Acest protocol descrie metoda de determinare a lipolizei bazale și stimulate de forskolin în tampoanele de grăsime inghinale obținute din dieta normală Chow (NCD) sau dietă bogată în grăsimi (HFD) ± șoareci de tip sălbatic hrăniți cu capsaicină. Eliberarea glicerinei din tampoanele de grăsime inghinale a fost măsurată ca un indice pentru lipoliză.

forskolin

Abstract

Lipoliza este un proces în care lipidele stocate ca trigliceride în țesuturile adipoase sunt hidrolizate în glicerol și acizi grași. Acest articol descrie metoda de măsurare a lipolizei stimulate bazale și forskoline (FSK) în tampoanele de grăsime inghinale izolate de la șoareci de tip sălbatic, fie în dieta normală chow (NCD), dieta bogată în grăsimi (HFD), fie o dietă bogată în grăsimi 01% des capsaicină (CAP; agonist al subfamiliei vaniloide 1 (TRPV1) potențial receptor receptor tranzitor) au fost hrăniți timp de 32 de săptămâni. Metoda descrisă aici pentru efectuarea lipolizei ex vivo este utilizată de Schweiger și colab. 1 Prezentăm un protocol detaliat pentru măsurarea nivelurilor de glicerol prin spectrofotometrie UV-Visible (UV/VIS). Metoda descrisă aici poate fi utilizată pentru a izola cu succes tampoane de grăsime inghinală pentru măsurători de lipoliză pentru a obține rezultate consistente. Protocolul descris pentru tampoanele de grăsime inghinale poate fi ușor extins pentru a măsura lipoliza în alte țesuturi.

Introducere

Țesuturile adipoase stochează energie sub formă de grăsime 2, iar oxidarea acizilor grași este necesară pentru termogeneza 3, 4. Acizii grași care sunt consumați prin diete sunt ambalați în chilomicroni împreună cu apoproteine ​​și eliberați în diferite țesuturi din organism prin fluxul sanguin. Deși majoritatea celulelor din corp stochează o rezervă de energie, țesutul adipos stochează excesul de energie sub formă de grăsime 5, 6. Lipoliza din țesutul adipos este reglementată de procese complexe, iar detaliile moleculare ale lipolizei rămân încă vagi 7 .

Lipoliza este un proces în care trigliceridele (TGL) stocate în țesutul adipos sunt hidrolizate pentru a produce glicerol și acizi grași (FA) de către enzima adipoză triglicerid lipază (ATGL) 8. Modificările lipolizei bazale și stimulate sunt o caracteristică definitorie a obezității. Lipoliza asală este reglată prin activarea ATGL 9, care transformă TGL în diacilglicerol (DAG), care este apoi hidrolizat în monoacilglicerol (MAG). Activarea lipazei sensibile la hormoni (HSL) prin adenilil ciclază activează stimularea protein-kinazei A (PKA) dependentă de adenozin monofosfat ciclic (AMPc) și provoacă lipoliză. Măsurarea lipolizei, bazală și stimulată, este, prin urmare, importantă pentru a analiza activitatea proteinelor implicate în acest proces. Descifrarea reglării moleculare a lipolizei poate fi, de asemenea, benefică în dezvoltarea de noi strategii terapeutice împotriva obezității 10. Deoarece moleculele care stimulează lipoliza și oxidarea acizilor grași sunt potențiali candidați pentru reducerea grăsimilor depozitate în depozite, este important să se utilizeze un test robust pentru reproductibilitate.

Datele publicate până acum sugerează că activarea proteinei TRPV1, exprimată în țesutul adipos alb, prin CAP și FSK (activator de adenilil ciclază) - a stimulat lipoliza în tampoanele de grăsime inghinale 11. Cercetările efectuate până în prezent sugerează, de asemenea, că activarea pe termen lung a TRPV1 de către CAP activează PKA12. Deoarece activarea PKA stimulează lipoliza 13, 14, atât lipidele bazale cât și cele dependente de PKA au stimulat lipoliza în tampoanele de grăsime inghinale, care după 32 de săptămâni de hrănire a dietelor respective de NCD sau HFD (± CAP) -Fed- Șoarecii au fost izolați pentru a valida rolul activării TRPV1 în lipoliză

Acest articol descrie o metodă eficientă pentru determinarea lipolizei bazale și stimulate. Deși sunt disponibile alte metode care asigură izotopi radioactivi ai glicerinei și cromatografie lichidă obositoare de înaltă performanță sau cromatografie de gaze/spectrometrie de masă pentru măsurători 15, 16, această metodă oferă o tehnică simplă, simplă și ieftină pentru determinarea lipolizei în țesutul adipos.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate protocoalele respectă orientările privind bunăstarea animalelor ale Universității din Wyoming.

1. Creșterea și hrănirea animalelor

NOTĂ: Șoarecii masculi adulți de tip sălbatic (C57BL/6) (cu vârsta cuprinsă între 12 și 24 de săptămâni) au fost crescuți în unitatea de cercetare a animalelor conform protocoalelor aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC).

  1. Începând cu săptămâna a 6-a, șoarecii găzduiesc în grupuri de patru persoane în cuști separate și le atribuie în mod aleatoriu grupurilor de hrănire a NCD sau HFD (± 0,01% CAP) până la săptămâna 38.
    NOTĂ: CAP este un agonist al proteinei canalului TRPV1 exprimat în țesuturile adipoase 11, 17. Se amestecă CAP cu HFD într-un blender din hota și se transferă amestecul mixt într-o tavă cu separatoare mici 1 la 2. Păstrați tava într-un congelator la -20 ° C. Scoateți tava cu dieta HFD + CAP din congelator după 24 de ore și păstrați-o într-un recipient la congelator la -20 ° C până la utilizare.
  2. Șoareci de casă într-un mediu cu aer condiționat (22,8 ± 2,0 ° C, 45-50% umiditate) cu un ciclu de lumină/întuneric 12/12 cu acces la o dietă desemnată și apă ad libitum .
  3. La sfârșitul a 38 de săptămâni, secretați țesut adipos adinos și utilizați pentru experimentele de lipoliză (secțiunile 2-7).

2. Pregătiți șoareci pentru experimente

  1. Anesteziați șoarecii prin injectarea unui amestec de ketamină și xilazină (10 mg/kg și, respectiv, 80 mg/kg greutate corporală). Injectarea a 0,01 ml amestec/10 g greutate corporală a șoarecelui.
  2. Confirmați anestezia profundă cu o ciupire fermă a degetelor. Dacă există un reflex de pedală, testați din nou mouse-ul după cel puțin 30 de secunde.
  3. Utilizați medicamente veterinare pentru a preveni uscarea ochilor în timpul anesteziei. Nu lăsați șoareci nesupravegheați în timpul oricăreia dintre proceduri.
  4. Eutanasiați șoarecii prin injectarea unei doze mari de injecție mixtă de ketamină și xilazină (10 mg/kg și respectiv 80 mg/kg greutate corporală) E (0,01 ml/10 g greutate corporală) urmată de luxație cervicală.
    NOTĂ: Această metodă de eutanasie este aprobată de Universitatea din Wyoming IACUC.

3. Izolarea tampoanelor de grăsime adipoasă inghinală

15 minute).

  • Izolați tampoanele de grăsime din partea dreaptă a mouse-ului așa cum este descris în pașii 3.2-3.6.

    • 4. Eliberarea bazică a glicerinei din tampoanele de grăsime inghinală

    5. Lipoliza stimulată de FSK

    6. Pregătirea reactivului glicerol liber

    1. Reconstituiți reactivul de glicerină 19 în 40 ml apă deionizată într-un flacon de sticlă chihlimbar, puneți un dop pe flacon și amestecați de 10 ori. Nu amestecați prin agitare.
    2. Păstrați flaconul la 4 ° C într-un frigider departe de lumină, acoperind flaconul complet cu folie de aluminiu.
    3. Continuați să pregătiți standardul de glicerină (secțiunea 7).

    7. Pregătirea etalonului de glicerină și determinarea conținutului de glicerină

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Rezultate reprezentative

    Lipoliza
    (Nmol glicerină/mg proteină/h)         		NCD
    (N = 6)         		HFD
    (N = 6)         		HFD + CAP
    (N = 6)
    Basal 16,22 ± 1,28 17,16 ± 1,48 52,07 ± 2,66
    FSK stimulează
    (Cu triacsin C)    		 54,88 ± 3,27 41,23 ± 4,43 72,04 ± 4,16

    Tabelul 1: Efectul CAP asupra lipolizei bazale și stimulate de FSK cu tampoane de grăsime inghinale. Eliberare medie de glicerină bazală și stimulată de FSK ± SEM, măsurată în țesutul adipos inghinal, obținută de la șoareci de tip sălbatic alimentați cu NCD-, HFD- sau HFD + CAP.

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Discuţie

    Procesul de degradare a TGL în glicerol și acizi grași este catalizat de ATGL 9 în timpul lipolizei bazale și orchestrat de o serie de proteine, inclusiv activarea căii dependente de adenilil ciclază/PKA în timpul lipolizei stimulate 21, 22, 23. Îmbunătățirea lipolizei crește nivelul plasmatic al acizilor grași pentru transport și cheltuieli energetice Acizii grași sunt absorbiți de mitocondrii sub formă de acetil-CoA, care este utilizat pentru energie.

    Acest articol descrie metoda de măsurare a eliberării glicerinei din țesutul adipos alb. Deși sunt disponibile mai multe metode cu izotopi stabili de glicerină, acestea necesită fie cromatografie lichidă de înaltă performanță, fie cromatografie gazoasă/spectrometrie de masă pentru măsurători 15, 16. Măsurătorile glicerinei radio-trasoare sunt, de asemenea, asociate cu nespecificități 31. Metodele alternative includ determinarea nivelurilor de ARNm și proteine ​​ale lipazelor și proteinelor reglatoare implicate în lipoliză. Metodele colorimetrice sunt, de asemenea, disponibile pentru concentrația de acizi grași cu lanț lung în circulație. Metoda descrisă aici este foarte eficientă în analiza eliberării glicerinei din țesuturile adipoase, așa cum se poate face cu un cititor de plăci capabil să măsoare fluorescența și absorbanța. Metoda analitică simplificată pentru eliberarea glicerinei descrisă în acest articol oferă, de asemenea, stabilitate și precizie îmbunătățite 32 .

    Procedurile de operare standard ar trebui practicate, deoarece această metodă implică tehnici chirurgicale pentru izolarea depozitelor de grăsime. Acest protocol recomandă utilizarea BSA fără grăsimi. Acest lucru poate duce la formarea de bule de aer care vor afecta măsurarea absorbției. Prin urmare, este important să vă asigurați că probele sunt manipulate pentru a evita bulele de aer. Trebuie avut grijă să nu se agite sau să se inverseze probele în timpul tratamentului cu BSA, cu excepția cazului în care un astfel de pas este recomandat în protocol. De asemenea, etapa de extracție a grăsimii din grăsimea inghinală este esențială deoarece prezența grăsimii interferează cu determinarea proteinelor din țesutul adipos inghinal H. În plus, atunci când pregătiți standardele de glicerină, este important să amestecați conținutul prin inversare și să nu scuturați flaconul.

    Procedura descrisă aici poate fi utilizată pentru a izola cu succes plăcuțele inghinale pentru teste multiple, inclusiv măsurători de lipoliză. Protocolul de lipoliză descris pentru tampoanele de grăsime inghinală poate fi ușor extins pentru a măsura lipoliza în alte țesuturi. Metodele sunt optimizate pentru toate tipurile de tampoane de grăsime și preadipocite.

    Pe scurt, acest articol descrie metoda de măsurare a eliberării glicerinei bazale și stimulate de FSK în acizi grași inghinali izolați de la șoareci alimentați NCD sau HFD (± CAP). Datele prezentate sugerează că activarea TRPV1 prin CAP a crescut lipoliza bazală și stimulată de FSK și a împiedicat acumularea de lipide în țesutul adipos. Aceste date arată un rol critic pentru proteina TRPV1 în reglarea lipolizei în țesutul adipos alb

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.