Mir-146a-5p inhibă activarea și proliferarea celulelor stelate hepatice din

Subiecte
Abstract
introducere
Rezultate
Expresia diferențială a miARN-urilor hepatice la șoareci cu steatohepatită fibroasă
Analiza ontologiei genelor și analiza căii microarray ADN pentru miARN exprimate diferențial
Validarea expresiei miARN prin PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR)
miR-146a-5p a fost reglementat în jos în HSC activat in vitro
Supraexprimarea miR-146a-5p a inhibat proliferarea HSC
Efectele miR-146a-4p asupra activării HSC și depunerii de colagen
miR-146a-5p acționează direct asupra 3'UTR-urilor mARN-urilor Wnt1 și Wnt5a
miR-146a-5p Wnt1 și Wnt5a reglate în jos la nivel post-transcripțional
Efectele supraexprimării și inhibării miR-146a-5p asupra genelor țintă în aval de calea de semnalizare Wnt
Knockdown-ul Wnt1 sau Wnt5a a inhibat expresiile genice ale semnalizării Wnt în aval și fibrogenezei
Discuţie
Metodele
Modele animale de steatohepatită fibroasă nealcoolică
Analiza histologică și analiza biochimică
Microarray Microarray Assay
Analiza QRT-PCR
Identificarea potențialelor ținte ale genei miARN
Izolarea, cultura și identificarea HSC
transfecția miR-146a-5p în HSC
Interferența și transfecția ARN
Analiza imunocitochimică
Test de proliferare celulară
Analiza Western blot
Testul activității luciferazei
analize statistice
Informatii suplimentare
Informatii suplimentare
Fișiere PDF
Informatii suplimentare
comentarii

Subiecte

Fibroza hepatică
Boală hepatică grasă nealcoolică

Abstract

introducere

Steatohepatita nealcoolică (NASH) face parte din spectrul steatozei hepatice grase nealcoolice (NAFLD), caracterizat prin steatoză, inflamație lobulară și fibroză pericelulară progresivă 1. În caz de leziuni hepatice prelungite, steatohepatita poate evolua spre fibroză hepatică asociată cu acumularea excesivă a matricei extracelulare (ECM). Celulele stelate hepatice (HSC) joacă un rol central în patogeneza fibrozei hepatice 2. HSC în repaus pot fi activate ca răspuns la steatohepatita cronică 3. HSC-urile activate stimulează producția de colagen și acumularea de ECM, ducând la dezvoltarea fibrozei hepatice 4. În ciuda progreselor fundamentale în înțelegerea fiziopatologiei steatohepatitei fibroase fără alcool, mecanismele fibrogenezei în prezența steatohepatitei rămân evazive.

Rezultate

Expresia diferențială a miARN-urilor hepatice la șoareci cu steatohepatită fibroasă

Așa cum se arată în Figura 1, secțiunile hepatice ale șoarecilor hrăniți cu dieta MCD au prezentat o structură lobulară dezordonată, macrosteatoză în zona 3, necroză hepatocitară localizată sau focală, infiltrare inflamatorie și fibroză perisinusoidală (Fig. 1A).), Însoțită de o semnificativ mai mare ser. și nivelurile AST (P 2 ori) (Fig. 1C).

( LA ) Modificări histopatologice ale secțiunilor hepatice la șoareci care au alimentat dieta MCD și hematoxilina colorată și controlul eozinei (sus) și tricromatismul lui Masson (jos). ( ) Efectul dietei MCD asupra nivelurilor serice de ALT și AST. ( VS ) MiARN-uri reglementate diferit identificate de microarray-ul miARN. ( D ) Validarea datelor microarray de ADN folosind RT-PCR în timp real. Au fost efectuate analize triplicate pentru fiecare probă de ARN și cantitatea relativă a fiecărui miARN a fost normalizată la sn6 ARN. Valorile sunt medii ± SD, ** P

( LA ) Analiza categoriei GO bazată pe obiectivele prezise ale tuturor miARN-urilor reglementate diferențial. Axa verticală reprezintă categoria GO, iar axa orizontală reprezintă îmbogățirea GO. ( ) Analiza căii pentru miARN reglementate diferențial. Doar benzile cu P 6 CSH au fost recoltate de la fiecare șoarece. Puritatea HSC-urilor proaspăt izolate a fost determinată a fi mai mare de 95% prin metoda de excludere a albastruului tripan. Colorarea imunofluorescentă a α-SMA, un marker pentru activarea HSC, a arătat o creștere semnificativă a HSC primar activat in vitro (Figura 3A). Expresia miR-146a-5p s-a dovedit a fi puternic reglată în jos în HSC-uri activate (Figura 3B).

( LA ) Imagini morfologice reprezentative și colorare imunocitochimică a HSC activate și în repaus pentru desmin și α-SMA (400 ×). Expresia lui ( ) miR-146a-5p a fost examinat prin qRT-PCR în timp real. Valorile sunt medii ± SD, ** P # P

( LA ) Colorarea Desmin care indică proliferarea celulelor LX-2 și HSC-T6 scade atunci când miR-146a-5p este supraexprimată. ( ) miR-146a-5p a inhibat creșterea celulelor LX-2 și HSC-T6, așa cum este determinat de testele CCK-8. Valorile sunt medii ± SD, * P

( LA, VS ) potențiale site-uri de legare miR-146a-5p pe 3'UTRs ale Wnt1 și Wnt5a. ( , D ) Celulele HEK-293T au fost transfectate cu un vector reporter de luciferază care conține forma de tip sălbatic sau mutant de 3'UTR de Wnt1 și Wnt5a, în prezența mimicilor miR-146a-5p, control mimic, a miR-146a. Inhibitor -5p și control inhibitor, apoi evaluat pentru activitatea reporterului luciferazei la 48 de ore după transfecție. Valorile sunt media ± abaterea standard, * P # P # P ## P

( LA ) nivelurile de ARNm și proteine ( ) β-catenină, GSK-3β și NFAT5 la șoareci hrăniți cu ficat cu o dietă MCD și în martori. ( VS ) HSC-T6 au fost transfectate cu un inhibitor miR-146a-5p sau control inhibitor, mimice miR-146a-5p sau un control mimetic timp de 48 de ore. Nivelurile de ARNm și proteine ( D ) β-catenina, GSK-3β și NFAT5 au fost analizate prin RT-PCR în timp real și respectiv Western blot. Β-actina a fost utilizată ca control al încărcării. Valorile sunt medii ± SD, ** P

În concluzie, am identificat miARN hepatice și am evaluat profilurile lor de expresie în steatohepatita fibroasă nealcoolică indusă de dieta MCD folosind microcipul. Dintre miARN-urile validate, miR-146a-5p a fost puternic subregulat în steatohepatita fibroasă nealcoolică și în HSC activate. Supraexprimarea miR-146a-5p a contribuit la dezvoltarea fibrozei hepatice prin inhibarea proliferării, activarea HSC și depunerea colagenului, suprimarea căii de semnalizare Wnt. Prin urmare, miR-146a-5p ar putea servi ca un nou regulator în patogeneza steatohepatitei fibroase nealcoolice.