Producția de insulină
Diabetul este boala numărul unu a civilizației. În tipul I, insulele Langerhans sunt distruse de sistemul imunitar. Acest tip apare înainte de vârsta de 20 de ani. În tipul II (diabetul cu debut la adulți), care apare la majoritatea diabeticilor, există niveluri normale sau crescute de insulină în sânge, dar modificările locului în care funcționează hormonul îi vor reduce funcționalitatea.
Nevoia de insulină este extrem de mare. Folosirea bacteriilor modificate genetic face astăzi mai ușor de acoperit decât înainte. Înainte de utilizarea bacteriilor, insulina a fost obținută din pancreasul porcilor sau bovinelor. Un diabetic a folosit pancreasele de la aproximativ 50 de porci pentru a-și acoperi necesarul anual.
Ce s-a întâmplat?
Acesta explică ce procese interne celulare au loc în celulele beta care duc la insulină activă.
Cum se poate produce insulina umană cu ajutorul bacteriilor.
Insulina - producția la om
Insulina este un hormon foarte mic format din două lanțuri de aminoacizi (lanțurile A și B). Lanțul A este format din 21 de aminoacizi, lanțul B din 30 de aminoacizi.
Ambele lanțuri sunt sintetizate mai întâi ca parte a unui lanț 110 AA. Această formă lungă este preproinsulină.
24 de aminoacizi ai acestui precursor semnalizează reticulul endoplasmatic pentru a-l prelua. Această secvență de semnal este împărțită în timpul înregistrării.
Restul de 86 de aminoacizi formează proinsulina (lanțurile A, B și C). Lanțurile A și B interacționează prin punți disulfură (-S-S-).
Lanțul C (peptida C) este apoi separat enzimatic.
Peptida C asigură o aliniere corectă din punct de vedere spațial a lanțurilor A și B (formarea punților disulfură); aceasta este singura modalitate de funcționare a insulinei.
Modificarea unui precursor de proteină în timpul sau după traducere este cunoscută sub numele de procesare a proteinelor.
Cum se face insulina umană cu E. coli
Pasul 1
ARNm de proinsulină modificat este izolat și sintetizat prin transcriptază inversă pentru a forma un hibrid ARN-ADN.
pasul 2
Catenă unică de ADN este completată cu ajutorul ADN polimerazei. ADNc este gata.
pasul 3
Un codon de pornire este atașat enzimatic la ADNc de insulină (A.: TAC pentru AUG → metionină, începe codonul) și „capetele lipicioase” (B.: capete lipicioase) anexat.
Rezultat
„ADN-ul pasagerului” terminat constă astfel din „capetele lipicioase”, codonul de start și gena proinsulinei pentru lanțurile B, C și A.
Recombinați - încorporați în vector
ADN-ul străin obținut în acest mod este acum încorporat în vectorul pBR322. Vectorul conține gena pentru beta-galactozidază și o genă pentru rezistența la ampicilină.
Pasul 1
Prin tăierea cu Eco RI, ADN-ul străin trebuie încorporat în mijlocul genei pentru galactozidază.
pasul 2
Se creează capete „lipicioase” care sunt complementare ADN-ului străin.
pasul 3
Interacțiunea capetelor „lipicioase” introduce ADN-ul străin în plasmidă.
Pasul 4
Lacunele sunt închise de ligazele ADN. Plasmida recombinată este gata.
Importanța operonului pentru exprimarea genelor
Prin încorporarea genei proinsulinei în gena galactozidazei, operonul lac poate fi utilizat pentru exprimarea genei. În același timp, proteina galactozidază protejează componenta insulinei de propriile enzime ale celulei, proteaze, care descompun în primul rând proteinele mai mici imediat.
Metodele moderne folosesc gena triptofan sintază pentru a prelua gena proinsulinei, care este controlată de reprimarea enzimei. Operonul de triptofan conține, de asemenea, un mecanism care crește expresia genelor în caz de deficit de triptofan, care poate fi utilizat bine din punct de vedere tehnic.
Transformare - Selectare - Clonare
Plasmidele sunt introduse în E. coli prin transformare. Rezistența la ampicilină este utilizată pentru selecție. Bacteriile recombinate se înmulțesc în fermentatoare.
Din motive de siguranță, lanțurile de insulină A și B au fost exprimate separat în două tulpini de E. coli diferite pe o perioadă mai lungă de timp, pentru a exclude posibilitatea ca bacteriile să sintetizeze insulina umană. Bacteriile echipate în acest mod ar declanșa un șoc de zahăr dacă ar intra în intestinele noastre.
Express - Modificare
Expresia genică este pusă în mișcare prin adăugarea de lactoză. Gena beta-galactozidazei cu gena insulinei încorporată este exprimată. Se creează o proteină de fuziune a galactozidazei și proinsulinei.
Produsul genetic este izolat din mediul nutritiv prin centrifugare. Cu bromură de cianogen, partea beta-galactozidazei este separată de proinsulină prin distrugerea aminoacidului metionină încorporată în ea.
Proinsulina este modificată în insulină cu enzima tripsină. Deoarece bacteriile nu au enzima necesară, trebuie adăugată după curățare.
Producerea interferonului de către bacterii
Importanța exprimării genelor umane în celulele gazdă (bacterii, drojdii) este, de asemenea, clară din următorul exemplu de interferon. Ca ingredient activ în tratamentul cancerului sau al sclerozei multiple, a fost disponibil doar pentru câțiva oameni înainte de a fi fabricat cu bacterii modificate genetic. Până atunci, interferonul se obținea din celulele sanguine. Au fost necesari 50.000 de litri de sânge pentru 400 mg interferon. Astăzi poate fi produs în orice cantitate folosind celule recombinate de E. coli.