Protocol bidimensional de electroforeză pe gel (tradus în germană)
Prezentare generală
Electroforeza bidimensională pe gel (2DGE) este o tehnică care poate rezolva mii de biomolecule dintr-un amestec. Această tehnică implică două metode diferite de separare cuplate împreună: focalizarea izoelectrică (IEF) și electroforeza pe gel de poliacrilamidă dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE). Aceasta separă fizic compușii de-a lungul a două axe ale unui gel prin punctele lor izoelectrice (o proprietate electrochimică) și greutățile lor moleculare.
Procedura din acest videoclip acoperă conceptele cheie ale 2DGE și o procedură generală pentru caracterizarea compoziției unei soluții complexe de proteine. Trei exemple ale acestei tehnici sunt prezentate sub titlul de aplicații, inclusiv detectarea biomarkerilor pentru inițierea și progresia bolii, tratamentul de control la pacienți și studiul proteinelor după modificarea post-translațională (PTM).
Electroforeza bidimensională sau 2D pe gel este o tehnică care, folosind două metode de separare diferite, poate separa mii de proteine dintr-un singur amestec. Una dintre tehnici, SDS-PAGE sau electroforeza pe gel de poliacrilamidă dodecil sulfat de sodiu, nu separă complet amestecurile de substanțe complexe. Electroforeza în gel 2D împerechează SDS-PAGE pe o a doua metodă, focalizarea izoelectrică sau IEF, care se separă pe punctele izoelectrice, permițând soluția potențialului tuturor proteinelor dintr-o celulă pentru a se liza. Acest videoclip demonstrează principiile electroforezei în gel 2D, o procedură generală și câteva dintre aplicațiile sale biomedicale.
Electroforeza pe gel 2D începe cu IEF ca primă dimensiune. Fiecare proteină are un pH, numit punctul izoelectric, sau pI, unde sarcina netă este zero. Când o proteină este expusă unui câmp electric, aceasta se deplasează spre electrod cu sarcină opusă. Probele de interes sunt gradienții de pH imobilizați sau IPG, benzi încărcate cu amfoliți care au îngropat molecule cu grupe acide și bazice. Un câmp electric este apoi aplicat pe banda cu gradient de pH, provocând migrația proteinelor până când ating nivelul de pH al nivelului pI, unde își pierd sarcina netă.
Înainte de a rula a doua dimensiune, proteinele încorporate sunt tratate cu SDS, denaturându-le și oferind o sarcină negativă uniformă. Odată completate, benzile IPG sunt plasate pe un gel de poliacrilamidă. Un câmp electric aplicat trage proteinele către anod cu proteine mai mari care se mișcă încet prin gel.
Odată ce amestecul de proteine a fost separat în funcție de pI și greutatea moleculară, harta proteomului este vizualizată cu pete și sunt identificate proteinele de interes.
Acum, că am discutat principiile electroforezei pe gel 2D, să trecem peste o procedură tipică de laborator.
Înainte ca experimentul să poată fi realizat, proteinele trebuie solubilizate în mediu. Solubilizarea probei se face prin dezagregarea proteinelor cu o combinație de agenți caotropici pentru perturbarea interacțiunilor legăturii de hidrogen, detergenți neionici, prevenirea modificării încărcăturii proteinelor, reducerea agenților, ruperea legăturilor disulfură și a tampoanelor. Pentru a elimina proteinele abundente care interferează și alte molecule, materialul este extras succesiv prin centrifugare și colectare din peleta rezultată; urmat de tratamentul cu endonuclează, o enzimă utilizată pentru a nu consuma ADN care ar interfera cu experimentul.
Odată ce proteinele s-au solubilizat, benzile IPG sunt preparate prin clătire cu o soluție de curățare a benzilor și permițându-le să se usuce cu susul în jos. Fiecărei benzi i se atribuie apoi un număr de suport pentru benzi. Odată ce ați terminat, banda este încărcată într-o mișcare lentă, de alunecare de la polul negativ la polul pozitiv al extractului celular. În scopul rehidratării, hârtia umedă este plasată pe electrod și sub benzile de gel; benzile IPG sunt apoi tivite pe instrumentul IEF. Se aplică un curent electric ridicat, iar proteinele încep să migreze.
După finalizarea primei dimensiuni, gelul este gata pentru SDS-PAGE într-un dispozitiv de turnare. Fâșiile IPG vor fi tratate prin plasarea lor în tamponul de echilibrare care conține SDS. Unitatea de electroforeză este preparată cu adăugarea unui tampon de electroforeză. Fâșiile IPG tratate sunt colectate cu pensă, așezate pe plăcile de gel și sigilate cu soluție de etanșare la agaroză. O sursă de tensiune aplică apoi un câmp electric care este ținut până când proteinele care se mișcă cel mai rapid sunt la 1 cm deasupra fundului gelului.
După terminarea electroforezei, proteinele trebuie vizualizate. În mod tradițional, acest lucru se face prin colorarea cu azot Coomassie sau azotat de argint. Proteinele de interes sunt transferate din gel prin analiza Western blot și sunt analizate.
O a doua abordare de identificare implică excizia proteinelor din gel, digerarea lor pe măsură ce sunt analizate prin spectrometrie de masă.
Acum, că am analizat o metodă, să luăm în considerare unele dintre utilizările pentru electroforeza pe gel 2D.
Una dintre cele mai frecvente utilizări pentru această tehnică este identificarea moleculelor implicate în inițierea și progresia bolii. Electroforeza în gel 2D, împreună cu spectrometria de masă, recunoaște reglarea în sus sau în jos a proteinelor specifice în zonele bolnave, comparativ cu cele sănătoase.
În plus, electroforeza pe gel 2D este utilă în urma progresului pacientului ca răspuns la un potențial medicament terapeutic. Probele pot fi prelevate de la pacienți în momente diferite după tratament. În acest fel, electroforeza în gel 2D asociată cu Western blot sau analiza spectrometriei de masă poate detecta proteinele asociate cu reacții negative, cum ar fi inflamația; sau lipsa proteinelor într-o stare temperată.
Un alt domeniu de aplicare pentru electroforeza în gel 2D este studiul structurii și funcției proteinelor după modificarea post-translațională sau PTM, care sunt adăugări la proteinele care sunt după traducerea lor din ARNm. PTM poate îndeplini o varietate de funcții, inclusiv semnalizarea proteinelor, reglarea expresiei genelor sau provocarea de daune oxidative. Electroforeza pe gel 2D este sensibilă la modificări precum metilarea sau acetilarea, care pot provoca o schimbare a pI și a greutății moleculare.
Tocmai ați urmărit videoclipul lui JoVE pe electroforeză pe gel 2D. Acest videoclip a descris principiile tehnicii, o procedură experimentală tipică și câteva dintre aplicațiile sale în domeniul biomedical.