Protocolul modelului de șoarece infectat cu Salmonella cronică (tradus în germană)

rezumat

Stabiliți un model de șoarece cu infecție bacteriană cronică cu colonizare persistentă a Salmonella Typhimurium în intestin timp de 27 de săptămâni.

Abstract

Modelul de șoarece cu infecție bacteriană este un model puternic pentru studiul unor domenii precum infecția, inflamația, imunologia, transducția semnalului și tumorigeneză. Mulți cercetători au profitat de colita indusă de Salmonella Typhimurium pentru studii privind stadiile incipiente ale inflamației și infecției. Cu toate acestea, puține rapoarte de infecție cronică sunt in vivo. Șoarecii cu existență persistentă Salmonella în tractul gastro-intestinal ne permit să explorăm interacțiunea gazdă-bacterie pe termen lung, transducția semnalului și tumorigeneză. Am stabilit un model de șoarece cu infecție bacteriană cronică cu colonizarea Salmonella Typhimurium în intestinul șoarecelui în decurs de 6 luni. Pentru a utiliza acest sistem, este necesar ca cercetătorul să învețe cum să pregătească cultura bacteriană și să distrugă animalele. Vom detalia o metodologie pentru prepararea șoarecilor de cultură bacteriană și gavage. Arătăm, de asemenea, modul în care Salmonella detectează persistența în tractul gastro-intestinal. În general, acest protocol îi va ajuta pe cercetătorii cu modelul de șoarece cu infecție bacteriană să răspundă fundamental la întrebări biologice și microbiologice.

Protocol

Acest protocol are trei părți: cultură bacteriană, tub nazogastric de șoarece și detectarea salmonelei.

1. Starea de creștere a Salmonella.

  1. Pregătiți placa Salmonella Luria-Bertani Broth (LB), incubați la 37 ° C peste noapte.
  2. Alegeți o clonă din placa LB și puneți-o în 7 ml LB într-un tub de 12 ml și agitați la 37 ° C timp de aproximativ 5 ore.
  3. Se inoculează 50 ml LB cu 0,05 ml dintr-o fază staționară a culturii și la 37 ° C fără agitare timp de aproximativ 18 ore.
  4. Rotiți peste noapte cultura bacteriană la temperatura camerei la 6000 rpm timp de 10 minute pentru a suspenda bacteriile în HBSS cu un raport de 100: 3 (LB: HBSS). De exemplu:
    Fiecare cultură LB de 50 ml va fi suspendată în 1,5 ml HBSS.
  5. Pentru tubul de hrănire a animalelor, diluați în continuare cultura bacteriană la un raport 1:10. De exemplu:
    Fiecare cultură de 1,5 ml LB va fi suspendată în 15 ml HBSS.

2. Modelul infecției cu Salmonella *.

  1. Pregătiți soluția de streptomicină. Fiecărui șoarece i se vor administra 7,5 mg de streptomicină în 100 pl de HBSS. De exemplu, pregătiți un total de 90 mg de streptomicină în 1,2 ml de HBSS pentru 10 șoareci. Întotdeauna un pic mai mult volum când pregătiți soluția de streptomicină.
  2. Retrați apa și alimentele cu 4 ore înainte de tratamentul oral.
  3. Șoareci ștergeți cu streptomicină cu 7,5 mg streptomicină (100 pl HBSS pentru șoareci martori). Prindeți ferm pielea peste umărul mouse-ului cu degetul mare și degetul mijlociu, îndreptați capul și gâtul cu degetul arătător pentru a face esofagul drept. Aliniați vârful bilă al acului de alimentare pe acoperișul gurii și pe partea dreaptă a spatelui gâtului, apoi treceți-l ușor în esofag și injectați 100 μl de soluție. Nu trebuie simțită nicio rezistență.
  4. La 20 de ore după tratamentul cu streptomicină, apa și alimentele sunt retrase din nou înainte ca șoarecii să fie infectați cu bacterii.
  5. Degajați fiecare șoarece tratat cu 100 pl suspensie în HBSS sau cu HBSS steril (martor) pe cale orală. Procedura de gavage este aceeași cu 2,3) șoareci de gavage cu streptomicină.

* Studiile pe animale au fost efectuate folosind șoareci femele C57BL/6 fără patogeni specifici (Taconic, Hudson, NY) cu vârsta de 6-7 săptămâni, așa cum este descris mai sus 1. Protocolul a fost aprobat de Comitetul pentru Resurse Animale al Universității din Rochester (UCAR).

3. Detectarea Salmonella în intestin.

  1. Colectați fecalele cu mouse-ul (aproximativ 100 mg).
  2. Transferați eșantionul de scaun într-un tub de microcentrifugă de 1,5 cu 1 ml PBS și rotiți puternic.
  3. Centrifugați timp de 10 minute la 800 de rotații pe minut. Transferați supernatantul într-un tub curat de microcentrifugă.
  4. Centrifugarea la 6000 rpm timp de 5 min. Supernatantul este aruncat și 200 pl de PBS se adaugă la pelete și se agită.
  5. Striați cei 200 μl de PBS cu un agitator de celule de unică folosință pe o placă BBL CHROMagar pentru a detecta Salmonella. Salmonella apare mov (roz până la violet, vezi Figura 1). Dacă 200 μl produce prea multe colonii pe placă, utilizați 100 μl sau 50 μl pentru bandă.

4. Rezultate reprezentative.

Dacă protocolul este realizat corect, colonizarea Salmonella typhimurium poate fi detectată în intestinul șoarecelui mai mult de 6 luni. Salmonella ar putea fi detectată prin cultură fecală timp de 6 luni (Fig. 1). Ca tipic provenind de la acest model, pierderea în greutate corporală și moartea apar în decurs de 4 săptămâni de la infectare. În funcție de tulpinile de Salmonella utilizate pentru infecție, unii șoareci nu pot supraviețui mai mult de 6 luni.

protocolul
ilustrația 1. Salmonella intestinală la speciile Salmonella apare de culoare mov (roz până la violet), datorită diferențelor metabolice în prezența cromogenilor selectați. Alte bacterii sunt fie inhibate, fie produc colonii albastru-verzui sau incolore.

șoarece
Figura 2. Proporțiile de supraviețuire a șoarecilor infectați cu PhmonP mutant Salmonella, PhoP c Avra- și PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra ​​timp de 4 săptămâni (28 de zile).

tabelul 1. Greutatea corporală a șoarecilor infectați cu Salmonella timp de 4 săptămâni.

0 1 săptămână 2 saptamani 3 saptamani 4 săptămâni
Control 16,78 ± 1,05 16,91 ± 1,28 18,26 ± 1,23 19,31 ± 1,26 20,26 ± 1,15
PhoP c 16,89 ± 1,03 17,14 ± 1,19 17,43 ± 1,63 * 18,68 ± 1,78 20,05 ± 1,11
PhoP c Avra- 16,91 ± 1,12 16,96 ± 1,39 17,06 ± 2,14 ** 18,71 ± 2,18 20,15 ± 1,56
PhoP c AvrA-/AvrA + 16,94 ± 0,96 17,17 ± 1,02 17,63 ± 1,42 * 18,44 ± 2,03 20,09 ± 1,17

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Pentru a utiliza acest sistem, este necesar ca cercetătorul să învețe cum să hrănească animalele printr-un tub nazogastric. Detaliem o metodologie pentru prepararea culturii bacteriene și distrugeți șoarecii. Arătăm, de asemenea, cum să monitorizăm persistența Salmonella în tractul gastro-intestinal (tractul gastrointestinal). Pașii critici ai acestui protocol, inclusiv:

  1. Pretratamentul cu streptomicină: pretratamentul cu streptomicină ar putea scăpa de flora intestinală comensală și ar putea face șoarecii susceptibili la infecția cu salmonella 2.
  2. Tub de alimentare cu Salmonella: Pentru începători, tubul de alimentare ar putea fi o provocare. La un moment dat, un tub nazogastric eșuează, deoarece soluția este injectată accidental în căile respiratorii și provoacă moartea șoarecilor.
  3. Colonizare bacteriană persistentă: necesită o monitorizare atentă a bacteriilor din tractul gastro-intestinal. În plus față de cultura fecală de șoarece, conținutul apendicelui poate fi utilizat și pentru detectarea Salmonella în plăcile BBL CHROMagar. Colectați conținutul apendicelui atunci când sacrificați șoareci după infecția cu Salmonella.

Am testat colonizarea salmonelei la șoareci la diferite concentrații: 1 x 10 3 unități formatoare de colonii la 1 x 10 8 unități formatoare de colonii (100 μl/șoarece). La 1 x 6-10 x 10 8 unități care formează colonii, Salmonella a reușit să colonizeze șoarecii. Prin urmare, pe baza publicațiilor noastre anterioare 1, 5 și a datelor nepublicate, concentrația finală de Salmonella în această soluție nu va fi măsurată înainte de hrănirea tubului gastric.

În această procedură experimentală avem șoareci C57BL/6 femele fără patogeni specifici (Taconic, Hudson, NY) care aveau vârsta de 6-7 săptămâni. Tulpinile bacteriene utilizate includ tulpina de tip sălbatic Salmonella typhimurium ATCC14028s (WT-SL), mutant nepatogen Salmonella PhoP c3, PhoP c Avra ​​și PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra ​​(Tabelul 2). Folosind acest protocol, colonizarea Salmonella typhimurium în intestinul șoarecelui poate fi detectată mai mult de 6 luni (Fig. 1). Infecția și inflamația Salmonella măsurate prin observarea fecalelor și a greutății băieților. Când s-au recoltat probe de țesut și sânge, lungimea intestinului a fost măsurată ca o caracteristică a inflamației intestinului. Au fost examinate și greutățile splinei și ale ficatului. Citokinele serice de șoarece au fost testate prin ELISA5. Mai mult, metodele biochimice și moleculare sunt utilizate în continuare pentru a testa modificările citokinelor inflamatorii și modificările patologiei induse de Salmonella 5.

De obicei, pierderea în greutate și moartea apar în decurs de 4 săptămâni de la infecție (Tabelul 1). După infecția cu Salmonella, s-a înregistrat o pierdere semnificativă a greutății corporale în grupurile de infecție bacteriană comparativ cu grupul de control fără tratament bacterian (* infectate cu PC, 78% PhoP c Avra- sau 70% PhoP c AvrA-/AvrA + pot persista cu Salmonella supraviețuiește în intestin. După infecția acută, toți supraviețuitorii au purtat încă salmonella care ar putea fi detectată după infecție la 6 luni după procedura descrisă în această propunere. Odată ce șoarecii au supraviețuit la 3 săptămâni după infecție, șoarecii au câștigat greutate corporală și au avut loc mai puține decese. În plus, datele privind colorarea imunofluroscenței arată, de asemenea, invazia Salmonella în mucoasa intestinală la 27 de săptămâni după infecție (Fig. 3). Aceste date au arătat că PhoP c, PhoP c Avra ​​sau PhoP c AvrA/AvrA + poate fi utilizat pentru modelul infecției cronice.

Șoarecii cu factor de rezistență al gazdei Nramp1 +/+ sunt rezistenți la infecția cu Salmonella 3-6. Șoarecii C57/BL6 cu NRAMP au fost defecți în studiile actuale. Am constatat că 90% șoareci infectați cu tulpina patogenă Salmonella 14028 nu pot supraviețui mai mult de 4 săptămâni (datele nu sunt prezentate). Pentru a înțelege efectele pe termen lung ale S. de tip sălbatic Infecție cu tifimuriu, șoareci cu Nampr1 +/+ ar putea fi folosiți.

Acest model este stabilit într-un laborator BSL-2. Protocolul nostru este aprobat de Comitetul pentru Resurse Animale al Universității din Rochester (UCAR). Șoarecii care sunt infectați cu salmonella sunt susceptibili să experimenteze disconfort și stres și să devină mai puțin activi și să se miște lent. Blana lor poate fi înfundată și nu li se permite să se hrănească sau să bea în mod normal. Animalele vor fi atent observate și dacă există semne de disconfort, cum ar fi să nu ambuleze suficient de bine pentru a menține hidratarea și aportul caloric, dacă un șoarece a prezentat semne că a avut lichid aspirat sau a pierdut semnificativ în greutate (10% sau mai mult) 7 și nu a făcut-o imediat mor, șoarecele a fost eutanasiat uman. Tot personalul de laborator va fi instruit în observarea șoarecilor în conformitate cu 8, 9.

Multe studii privind pretratarea streptomicinei au profitat de colita indusă de Salmonella typhimurium pentru studii privind faza incipientă a infecției 1,2,10. Cu toate acestea, doar câțiva au raportat despre infecția cronică la modelul de șoarece in vivo 11. Șoarecii cu existență susținută de Salmonella în tractul GI ne permit să explorăm interacțiunea gazdă-bacterie pe termen lung, transducția semnalului și tumorigeneză. Am stabilit un model de șoarece cu infecție bacteriană cronică cu Salmonella typhimurium colonizând în intestinul șoarecelui timp de 6 luni. Acest model poate fi, de asemenea, utilizat pentru patogeneza E. coli și studii de probiotice. În ansamblu, acest protocol îi va ajuta pe cercetători cu modelul de șoareci fundamental important să răspundă la întrebări biologice și microbiologice.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.