Protocolul privind modelul mouse-ului de aprindere indus de pentilenetetrazol (tradus în germană)

rezumat

Acest protocol descrie o metodă de aprindere chimică cu pentilenetetrazol și oferă un model de epilepsie la șoarece. Acest protocol poate fi, de asemenea, utilizat pentru a investiga susceptibilitatea la inducerea convulsiilor și patogeneza după crize epileptice la șoareci.

Abstract

Introducere

Epilepsia este o tulburare neurologică cronică care se caracterizează prin convulsii recurente și afectează aproximativ 1% din oameni. Mecanismele care stau la baza epileptogenezei și generării de convulsii la pacienții cu epilepsie nu pot fi complet elucidate în studiile clinice. Prin urmare, este necesar un model animal adecvat pentru cercetarea epilepsiei 1.

O varietate de modele animale de epilepsie au fost utilizate pentru a studia fiziologia epilepsiei și pentru a identifica medicamente anti-epileptice 2, 3. Dintre aceste modele, inducerea crizei farmacologice este o metodă comună de generare a unui model animal pentru studierea patologiei epilepsiei 4. Această metodă este ieftină și ușoară. Iluminarea mediată de electrozi este, de asemenea, o metodă frecvent utilizată, dar costul procedurii este mai mare, iar metoda necesită abilități chirurgicale și electrice pentru a induce crize repetitive 5.

Inducția farmacologică este, de asemenea, benefică, deoarece calendarul și numărul convulsiilor sunt ușor de controlat. Modelele genetice de șoarece care prezintă convulsii spontane sunt, de asemenea, utilizate în studiul epilepsiei. Cu toate acestea, prezicerea când și cât de des vor apărea convulsiile în aceste modele genetice poate fi imposibilă 6. Este necesar un sistem de monitorizare pentru a observa comportamentul epileptic al șoarecilor modificați genetic 6.

Convulsiile sunt adesea induse de o singură administrare sistemică de PTZ, iar recuperarea este foarte rapidă, în decurs de 30 de minute 4, 5. În acest fel, numărul de convulsii în modelul PTZ-ignite este mai ușor de controlat. Cu toate acestea, monitorizarea EEG a indicat că vârfurile generalizate pot fi văzute până la 12 ore după convulsia mediată de PTZ 20. Prin urmare, animalele ar trebui să rămână de preferință sub observație 24 de ore după convulsia tonică sau mioclonică 21 pentru o analiză mai detaliată a mecanismelor care aprind.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science a aprobat toate procedurile experimentale. Se recomandă șoareci postnatali de 8-16 săptămâni. Orice tulpină de consangvinizare este acceptabilă pentru experiment. Șoarecii C57BL/6 sunt mai rezistenți la PTZ, în timp ce șoarecii BALB/c și Swiss Albino sunt mai sensibili la PTZ. C57BL/6 au fost utilizate în acest studiu. Sensibilitatea la PTZ depinde și de vârsta mouse-ului. În comparație cu șoarecii mai tineri, șoarecii mai în vârstă sunt mai refractari la PTZ-35. Numărul de animale utilizate pentru această metodă poate varia, dar este necesar un minim de 6-10 animale pentru fiecare afecțiune.

1. Se dizolvă 2 mg/ml PTZ în NaCI steril 0,9% (greutate/volum). Pregătiți PTZ în ziua utilizării.

1. Observați comportamentul animalului și înregistrați rezultatele.
   1. Clasificați și împușcați comportamentele epileptice după cum urmează 38, 39 (Figura 1b):
      0: comportament normal, fără anomalii.
      1: Imobilizare, întins pe stomac.
      2: Cap din cap, facial, membrele anterioare sau mioclonia Megalosauridae.
      3: Mioclon continuu al întregului corp, rătăciri mioclonice, coada rigidă.
      4: creșterea copiilor, criză tonică, cădere în jos.
      5: criză tonico-clonică, care cade pe spate, se grăbește sălbatic și sare.
      6: moarte.
2. Schimbați criteriile de comportament folosind Scorul Racine 40, în funcție de condițiile experimentale.

4. După analiza convulsiilor

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Injecția repetată de PTZ induce o creștere a severității convulsiilor. Șase șoareci C57BL/6 au fost tratați cu PTZ și alți 6 șoareci au fost tratați cu soluție salină ca grup de control. Doza de PTZ a fost de 35 mg/kg și s-au administrat 10 injecții. Scorul convulsiilor a crescut treptat odată cu injecțiile cu PTZ, în timp ce nu s-au observat convulsii sau comportamente anormale la injecțiile cu soluție salină (Figura 2) au fost cauzate. ANOVA urmat de testul lui Bonferroni a arătat o diferență semnificativă între grupul tratat cu PTZ și grupul tratat cu soluție salină.

Crizele repetitive favorizează formarea aberantă a ramurilor axonale (germeni de fibre mușchii) și migrația anormală a celulelor granulare din hipocamp. Șoarecii au fost tratați cu PTZ pentru 25 de injecții (doza a fost ajustată de la 24 mg/kg la 35 mg/kg pentru a păstra criza severă la șoareci fără a induce moartea din cauza unei crize severe). Creierul șoarecelui a fost fixat la 3 săptămâni după ultima injecție. Creierele de control au fost fixate înainte de injecțiile PTZ. Feliile de creier au fost imunizate cu anticorpi anti-sinaptoporină (x 500) și anti-ZnT3 (x 500) împotriva germenilor de fibre mușchii (Figura 3A) și cu anticorpul anti-dublecortină (x 200) pentru a observa migrația anormală a celulelor granulate (Figura 3A). Fibrele de mușchi au încolțit în stratul de celule granulare, au înregistrat discuri tratate cu PTZ (Fig. 3A). Celulele granulare nou-născute, imunoreactive pentru doublecortină, au fost localizate în hilus în feliile tratate cu PTZ (Figura 3A) observat. Stratul celular granular și hilus, prezentate în Figura 3A este în Figura 3 bafișate.

Discuţie

Aici vă prezentăm un protocol disponibil în general pentru stabilirea unui model animal farmacologic de epilepsie. Aprinderea chimică mediată de PTZ are o istorie lungă și este un model bine acceptat pentru studiul histopatologiei și patologiei celulare a epilepsiei 41. Modelul chimic de aprindere a epilepsiei a fost examinat anterior de Suzdak și Jansen, 1995 42. Inducerea convulsiilor farmacologice, în special cu PTZ, este o metodă simplă și simplă de a provoca convulsii severe. Modificările dozei de injecție sunt corelate cu severitatea convulsiilor. Prin urmare, este foarte ușor să identificați doza adecvată în mai multe studii prin schimbarea dozei PTZ și a comportamentului rezultat.

Mulți cercetători au încercat să modeleze șoareci knock-in sau knock-in, cum ar fi epilepsia și au reușit să producă șoareci care au crize spontane 43, 44. Cu toate acestea, inducerea crizelor farmacologice rămâne un model bun pentru epilepsie. O altă metodă comună de inducere a convulsiilor numită modificare genetică implică implantarea de electrozi în creierul unui animal și inducerea de crize mediate de electroșoc. Această metodă este costisitoare, dificilă și necesită abilități chirurgicale pentru a implanta electrodul în locația exactă din creier 5.

Inducerea chimică a convulsiilor permite investigarea rapidă a epileptogenezei și screening-ul medicamentelor anti-epileptice la un cost redus 2, 4. Frecvența și severitatea convulsiilor spontane și SE variază în funcție de medicamentul utilizat. Acidul kainic și pilocarpina sunt utilizate în principal pentru a provoca SE și ulterior convulsii cronice spontane sau recurente 45, 46, 47. Pe de altă parte, PTZ este utilizat atât pentru a promova SE atunci când vă dezvoltați într-o doză mare, cât și pentru animalele inflamate chimic atunci când vi se administrează într-o doză subconvulsivă 48,49. În plus, sunt cunoscute mecanismele medicamentelor convulsive care declanșează convulsii. De exemplu, blocarea mecanismului convulsivant poate ajuta la identificarea medicamentelor anti-epileptice. Pe de altă parte, sunt necesare modele genetice pentru a studia mecanismele care cauzează convulsii epileptice 50. După ce mecanismele care provoacă convulsii au fost clarificate, se poate începe screeningul pentru medicamentele antiepileptice.

În rezultatele reprezentative prezentate aici, comportamentul animalelor a fost observat timp de 30 de minute după administrarea PTZ. Cu toate acestea, după cum se menționează în secțiunea Protocol, comportamentul animalului este de preferat observat timp de 24 de ore sau cel puțin 6-10 ore după injectarea PTZ, mai ales atunci când punctele de convulsie ating 3 sau mai mult. Deși este necesar un sistem de supraveghere a animalelor pentru a observa animalul întreaga zi, observarea prelungită este esențială pentru a obține o înțelegere profundă a epilepsiei. În plus, durata convulsiei și latența convulsiilor sunt măsuri utile de colectat. Aceste măsurători sunt importante atunci când există modificări în durata convulsiei și a latenței în ceea ce privește timpul și severitatea convulsiei.

A fost studiată histopatologia post-convulsivă a animalelor alimentate chimic, în special în hipocamp. Crizele repetitive sau SE induc germeni de fibre mușchii, 27, 28, migrație anormală a neuronilor granulari nou-născuți 25, 29, astroglioză în hipocampus 30 și apoptoză a neuronilor piramidali 31, 32. aceste modificări histologice la nivelul creierului perturbă funcțiile neurologice la pacienții epileptici. De exemplu, este recunoscută asocierea epilepsiei cu tulburarea spectrului autist (ASD) și cu dizabilitatea intelectuală (ID) 51, 52, 53. Dacă crizele epileptice declanșează TSA și sau TEA și ID induc simptome epileptice este încă o întrebare complicată. Studii recente au arătat că convulsiile mediate de PTZ induc tulburări socio-cognitive 54 de tip ASD și deficite de învățare de tip ID 55, 56, 57. Aceste rezultate arată că histopatologia mediată de epilepsie provoacă disfuncții neuronale și tulburări psihiatrice.

Modificările histologice promovate de epilepsie necesită timp pentru a se dezvolta după inducerea convulsiilor. Inducerea crizei farmacologice este benefică în acest sens, deoarece cercetătorii pot controla momentul, numărul și severitatea convulsiilor la animale. Inclusiv aprinderea chimică, modelele animale de epileptogeneză continuă să promoveze investigarea mecanismului inducerii epilepsiei și a tulburărilor neurofiziologice conexe.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

---