Reglarea bolilor autoimune prin polimorfismul CT PTPN și gena NCF1
De la Institutul Hertie pentru Cercetarea Clinică a Creierului de la Universitatea din Tübingen Departamentul de Neurologie Generală Director medical interimar: profesor Dr. A. Reglarea Melms a bolilor autoimune de către polimorfismul PTPN22 1858 * C/T și disertația inaugurală a structurii genei/pseudogenei NCF1 pentru obținerea titlului de doctor în medicină al facultății medicale a Universității Eberhard Karls din Tübingen prezentată de Peter Hoffmann de la Stuttgart Bad Cannstatt 2010
Decan: Profesorul Dr. I. B. Autenrieth Raportor 1: profesorul Dr. Dr. R. Weissert Raportor al doilea: profesorul Dr. T. Gasser
Cuprins 1 Lista abrevierilor 1 2 Introducere și întrebare 3 2.1 Boli autoimune genetice complexe 3 2.1.1 Definiție și epidemiologie 3 2.1.2 Etiologie și patogeneză 3 2.2 Miastenia gravis și proteina tirozin fosfatază fără receptor 22 6 2.2.1 Miastenia gravis 6 2.2.1.1 Definiție 6 2.2.1.2 Epidemiologie 6 2.2.1.3 Simptome 6 2.2.1.4 Curs 7 2.2.1.5 Miastenie gravenală neonatală 8 2.2.1.6 Boli concomitente 8 2.2.1.7 Transmisie neuromusculară 8 2.2.1.8 Patogenie 10 2.2.1.9 Semnificația timusului 11 2.2.1.10 clasificări clinice și scoruri 12 2.2.1.10.1 Clasificare conform Ossermann și Genkins 12 2.2.1.10.2 Myasthenia Gravis Scor conform Besinger 13 2.2.1.11 Diagnostic 13 2.2.1.11.1 Testare farmacologică 13 2.2.1.11.2 Stimulare repetitivă utilizând electromiografie 13 2.2.1.11.3 Diagnosticarea anticorpilor 14 2.2.1.12 Terapie 15 2.2.1.12.1 Inhibitori ai acetilcolinesterazei 15 2.2.1.12.2 Terapia imunosupresivă 16 2.2.1.12.3 Timectomia 16 2.2.2 Protein tirozin fosfatază nereceptor 22 17 2.2.3 Întrebare de cercetare 18 2.3 Scleroză multiplă/malarie și factorul citosolic neutrofil 1 19 I.
2.3.1 Scleroza multiplă 19 2.3.1.1 Definiție 19 2.3.1.2 Epidemiologie 19 2.3.1.3 Tabloul bolii 20 2.3.1.4 Forme de curs 20 2.3.1.5 Criterii de diagnostic 21 2.3.1.6 Prognostică 24 2.3.1.7 Patogenie 25 2.3.1.8 Diagnostic 27 2.3.1.8. 1 Diagnostic CSF 27 2.3.1.8.2 Diagnostic electoral fiziologic 28 2.3.1.8.3 Tomografie prin rezonanță magnetică 28 2.3.1.8.4 Scale pentru evaluarea dizabilității 28 2.3.1.9 Terapie 28 2.3.2 Malarie 31 2.3.2.1 Definiție 31 2.3.2.2 Epidemiologie 31 2.3 .2.3 Ciclul de dezvoltare al parazitului 31 2.3.2.4 Simptome 32 2.3.2.5 Terapie 33 2.3.3 Metaboliți reactivi ai oxigenului 33 2.3.4 Factor citosolic neutrofil 1 35 2.3.4.1 Definiție 35 2.3.4.2 NADPH oxidază 35 2.3.4.3 Gena CF1 și pseudogeni 36 2.3.4.4 NCF1 și boli autoimune 40 2.3.5 Întrebare de cercetare 40 3 Material și metode 41 3.1 Miastenia gravis și PTPN22 41 3.1.1 Pacienți 41 3.1.2 Material și echipamente 41 3.1.2.1 Genotipare SNP 41 II
3.1.2.2 Anticorp anti-titin Elisa 41 3.1.2.3 Anticorp anti-AChR Radioimunoanaliză 42 3.1.3 Metode 42 3.1.3.1 Genotipare SNP 42 3.1.3.1.1 Mixare de genotipare SNP 42 3.1.3.1.2 Taqman Universal Master Mix 43 3.1.3.1.3 Reacție în lanț a polimerazei, principiu 43 3.1.3.1.4 Genotipare, principiu 43 3.1.3.1.5 Reacție în lanț a polimerazei, implementare 45 3.1.3.2 Anticorp anti-titin ELISA 46 3.1.3.2.1 Test imunosorbent legat de enzime, principiu 46 3.1.3.2.2 Anticorp anti-titin ELISA 46 3.1.3.3 Radioimunoanaliză anticorp anti-AChR 48 3.1.3.4 Analiză statistică 48 3.2 NCF1 și scleroză multiplă/malarie 49 3.2.1 Populația de pacienți 49 3.2.2 Material și echipamente 50 3.2.2.1 Separarea ADN-ului de sângele integral uman 50 3.2.2.2 Genotiparea NCF1 50 3.2.2.3 Electroforeza pe gel de agaroză 51 3.2.2.4 Separarea celulară a monocitelor și granulocitelor 51 3.2.2.5 Numărarea și diluarea celulelor polimorfonucleare și a celulelor mononucleare din sângele periferic 52 3.2. 2.6 Marcarea unui anticorp cu R-ficoeritrină 52 3.2.2.7 Test Bradford 53 3.2.2.8 Colorarea monocitelor și granulocitelor cu anticorpi marcați R-PE p47-phox (D-10) 53 3.2.3 Metode 53 3.2.3.1 Separarea ADN-ului din sângele integral uman 53 3.2. 3.2 Genotiparea NCF1 54 3.2.3.2.1 Taqman Universal Master Mix 54 3.2.3.2.2 Reacția în lanț a polimerazelor 55 III
3.2.3.2.3 Genotiparea 55 3.2.3.3 Electroforeza pe gel de agaroză 56 3.2.3.4 Separarea celulară a monocitelor și granulocitelor 56 3.2.3.4.1 Separarea celulară 56 3.2.3.4.2 Separarea monocitelor și limfocitelor 57 3.2.3.4.3 Separarea Granulocite 57 3.2.3.5 Numărarea și diluarea PMN-urilor și PBMC-urilor 58 3.2.3.6 Etichetarea unui anticorp cu R-ficoeritrină 58 3.2.3.6.1 p47-phox (D-10): sc-17845 58 3.2.3.6.2 Marcare 58 3.2 .3.7 Testul Bradford 59 3.2.3.7.1 Principiul 59 3.2.3.7.2 Procedura 60 3.2.3.8 Colorarea monocitelor și granulocitelor cu anticorpi marcați R-PE p47-phox (D-10) 60 3.2.3.9 Citometrie de flux/Triere celulară activată cu fluorescență 61 3.2.3.9.1 Principiu 61 3.2.3.9.2 Citometrie de flux 61 3.2.3.10 Analiză statistică 62 3.2.3.10.1 Malarie 62 3.2.3.10.2 Scleroză multiplă 62 4 Rezultate 63 4.1 Miastenia gravis și PTPN22 63 4.1.1 Rezultatele măsurătorilor 63 4.1.2 Frecvența alelelor și distribuția genotipului 63 4.1.3 Frecvențele alelelor în subgrupuri de pacienți cu SM 64 4.2 NCF1 și multiple Scleroză/Malarie 66 4.2.1 Cotații GT/GTGT și MS 66 4.2.2 Cotații GT/GTGT sunt asociați cu subfenotipuri de MS 66 4.2.3 Cotați GT/GTGT și malarie 69 4.2.4 Corelația GT/GTGT Cotient cu producția de ROS la pacienții cu malarie 70 IV
4.2.5 Coeficienți GT/GTGT și concentrația hemoglobinei 70 4.2.6 Citometrie de flux a monocitelor, limfocitelor și granulocitelor 71 5 Discuție 73 5.1 Miastenia gravis și PTPN22 73 5.1.1 Introducere 73 5.1.2 Asocierea polimorfismului PTPN22 cu miastenia gravis 73 5.1.3 Asocierea polimorfismului PTPN22 cu apariția anticorpilor anti-AChR și a anticorpilor anti-titin 73 5.1.4 Anticorpi anti-titin și timom 74 5.1.5 Genotipuri în funcție de starea timom 75 5.1.6 Analiza subgrupului pacienților MG fără timom 75 5.1.7 Comparația rezultatelor noastre cu studiile anterioare 76 5.1.8 Sumar și perspective 78 5.2 NCF1 și scleroză multiplă/malarie 79 5.2.1 Introducere 79 5.2.2 Cotații GT/GTGT la pacienții cu scleroză multiplă 79 5.2.3 GT/Cotații GTGT la pacienții cu malarie și comparație cu producția de ROS 80 5.2.4 Critica metodei 81 5.2.4.1 Genotiparea fragmentelor NCF1 81 5.2.4.2 Citometrie de flux a monocitelor, limfocitelor și granulocitelor 82 5.2 .5 Rezumatul și perspectivele 82 6 Rezumatul 83 6.1 Miastenia Gravis și PTPN22 83 6.2 NCF1 și scleroza multiplă 84 6.3 NCF1 și malaria 85 7 Bibliografie 86 Mulțumiri 104 Curriculum Vitae 105 V
Lista abrevierilor 1 Lista de abrevieri ACh = Acetilcolina AChR = Acetilcolina receptorilor AIE = Boli autoimune BSA = albumina serică bovină CTLA4 = citotoxică T-limfocitară Antigen 4 DNS = acid dezoxiribonucleic EAE = Experimental autoimuna Encephalomy = Förster = experimental autoimmune Encephalomy = Förster Stare = Expanded Encephalomy = Förster Stare Scale = Expanded Encephalomy = Förster = Expanded Encephalomy = Forward antigen leucocitar uman IVIg = imunoglobuline intravenoase KI = interval de încredere LYP = tirozin limfoid fosfatază MG = miastenie gravis MGB = liant minor de șanț MHC = complex major de histocompatibilitate MRT = imagistică prin rezonanță magnetică MS = scleroză multiplă NADPH = nicotinamidă citofosfat OR Raport s impar p47-phox = proteină47 fagocit oxidază PBMC = celule mononucleare din sânge periferic PBS = soluție salină fiziologică tamponată cu fosfat PCR = reacție în lanț a polimerazei Phox = bou fagocitar idază PMA = forbol-12-miristat-13-acetat PMN = celule nucleare polimorfe 1
Lista abrevierilor PTPN22 = proteină tirozin fosfatază nereceptor 22 RA = poliartrită reumatoidă ROS = metaboliți oxigen reactivi (specii de oxigen reactiv) R-PE = R-ficoeritrin SSC = dispersie laterală LES = lupus eritematos sistemic SNP = polimorfism nucleotidic unic 2
Introducere și întrebare de cercetare 2.2.1.8 Patogenie În MG, densitatea canalului ionic AChR este redusă pe placa musculară [Pestronk și colab., 1985] și placa finală este distrusă. Decalajul sinaptic dintre capătul nervos și membrana musculară postsinaptică crește [Engel și colab., 1976]. Canalele ionice AChR legate de autoanticorpi sunt endocitate și descompuse mai repede. Completată, legarea anticorpului duce la distrugerea aparatului postsinaptic cu o reducere a aparatului degetului postsinaptic (vezi Fig. 2). Anticorpii AChR blochează direct canalul ionic AChR [Köhler și colab., 2003]. Numărul redus de canale ionice AChR deschise are ca rezultat un potențial mai mic în placa musculară, care nu mai este suficient pentru a genera un potențial de acțiune. Un număr mai mic de fibre musculare activate duce la slăbiciunea musculară descrisă mai sus. Chiar și la pacienții cu simptome pur oculare, se observă o scădere a AchR la capetele extremităților, care, totuși, rămâne subclinică. A: transmisie neuromusculară sănătoasă B: transmisie neuromusculară în miastenie gravis Fig. 2: Transmisie neuromusculară [de la Drachman, D. B., 1994] 10
Introducere și întrebare de cercetare 2.2.1.9 Semnificația timusului La pacienții cu MG, timusul este adesea modificat morfologic. Există o timită cu hiperplazie limfofoliculară, o atrofie a timusului sau un timom. Un motiv pentru această asociere ar putea fi o mimică moleculară antigenică: antigenele proprii sau exogene care sunt similare cu epitopii canalelor ionice AChR activează celulele T autoreactive. Componentele virusurilor herpes simplex sau ale infecțiilor bacteriene în care se discută despre inducerea MG pot fi considerate antigene exogene [Schwimmbeck și colab., 1989]. În timomul malign, există o expresie crescută a neurofilamentelor, care ar putea funcționa ca determinanți autoantigenici deoarece au un epitop asemănător AChR. Se găsește timom în 8,5-15% din cazuri la pacienții cu MG [Wilkins și colab. 1999, Loehrer 1999, Otto 1998]. 11
Introducere și întrebare de cercetare 2.2.1.10 Clasificări clinice și scoruri 2.2.1.10.1 Clasificare în funcție de Ossermann și Genkins Clasificarea în conformitate cu Osserman și Genkins (a se vedea tabelul 1) a fost stabilită pentru a evalua severitatea stării bolii MG. Tabelul 1: Clasificarea miasteniei gravis în funcție de Ossermann și Genkins (1971) Clasa Formă clinică Simptome I Forma oculară Ptoză, diplopie IIa Formă generalizată ușoară Slăbiciune generalizată ușoară IIb Forma faciofaringiană IIa + slăbiciune bulbară III Formă generalizată acută severă Slăbiciune generalizată acută severă, simptome bulbare, insuficiență respiratorie IV severă formă generalizată cronică severă, deseori slăbiciune generalizată progresivă 12
Introducerea și întrebarea MG caracterizate în principal de slăbiciune orofaringiană și mai puține simptome oculare [Evoli și colab., 2003]. 2.2.1.12 Terapia Tratamentul MG se bazează pe următorii piloni [Köhler și colab., 2003]: - Administrarea inhibitorilor de ACh esterază, care îmbunătățesc transmisia neuromusculară - Terapia imunosupresivă sau imunomodulatoare pentru a reduce anticorpii antigeni -Reacție inflamatorie declanșată complexă - Măsuri terapeutice intervenționale pentru tratamentul deteriorării acute, cum ar fi o criză miastenică, de ex. schimbul plasmatic terapeutic prin intermediul plasmaferezei sau imunoadsorbției [Shibuya și colab., 1994] - timectomia 2.2.1.12.1 Inhibitori ai acetilcolinesterazei Inhibitorii de ACh esterază se leagă în vecinătatea unității catalitice a ACh esterazei și sunt semnificativ mai încet în comparație cu ACh hidrolizat. Gruparea carbamil este transferată covalent la ACh esteraza și inhibă activitatea enzimei timp de ore. Aprovizionarea cu ACh în decalajul sinaptic crește și ACh are mai mult timp pentru a ocupa locurile de legare ale membranei postsinaptice. Cel mai frecvent ingredient activ este bromura de piridostigmină (Mestinon) în doze de până la 300 mg/zi. 15
Inițierea și interogarea sunt diagnosticate dacă există o diseminare temporală și spațială a leziunilor, de ex. este detectabil prin imagistică (vezi Tabelul 2). Pentru a diagnostica SM, imaginile clinice similare (de exemplu colagenoză, vasculită, borrelioză sau sarcoid) trebuie excluse. SM este atunci când criteriile sunt îndeplinite și nu există o explicație mai bună pentru simptomele clinice. SM posibil este atunci când există suspiciuni, dar criteriile nu sunt îndeplinite pe deplin. 22
Introducere și întrebare de cercetare FAD = flavină adenină dinucleotidă Fe = fier GDI = inhibitor de disociere a guanozinei difosfatului PIB = difuzat de guanozină GTP = trifosfat de guanozină NADPH = nicotinamidă adenină dinucleotid fosfat unitățile legate de membrană gp91-phox și p22-phox. O interacțiune între p47-phox și unitățile legate de membrană este necesară pentru activare. În primul rând, proteina Rac trebuie să se detașeze de proteina Rho GDI și să intre într-o stare activată de GTP. Apoi, acest lucru poate intra în asociere cu membrana plasmatică. Complexul plasmatic necesită mai multe fosforilări, astfel încât să se conecteze cu unitățile legate de membrană. NADPH oxidaza activată produce anioni superoxizi care sunt eliberați în vezicule fagocitare sau în spațiul extracelular [Heyworth și colab., 2003]. Fig. 3: Activarea NADPH oxidazei [de la Heyworth și colab. 2003] 37
Introducere și întrebare În genomul uman există două pseudogene (ψncf1) per genă NCF1. Ele sunt 98% identice cu gena NCF1 și sunt localizate în aceeași regiune 7q11.23 pe cromozomul 7 [Heyworth, Cross și colab., 2003]. Se face distincția între ogenenncf1 de tip I, care conține ștergerea GT la începutul exonului 2 și tipul II ψncf1, care nu conține o ștergere GT [Heyworth, Noack și colab., 2002]. În populație există de obicei două haplotipuri diferite, haplotipul mai comun cu două copii de tip I ψncf1 și o copie a NCF1 și haplotipul mai puțin obișnuit cu câte o copie fiecare de tip I și tip II ψncf1 și o copie a genei funcționale [Heyworth et. al., 2002]. Apariția crescută a mutației GT în granulomatoza cronică poate fi explicată ipotetic prin evenimente de recombinare între NCF1 și tip I ψncf1 (vezi Fig. 4). Datorită apropierii și a gradului ridicat de similitudine, astfel de evenimente de recombinare ar putea apărea mai des. Tipul II ψncf1 apare probabil din recombinarea dintre NCF1 și tip I ψncf1. Fig. 4, modelul unui posibil crossover între NCF1 și Tipul I ψncf1 [de la Heyworth și colab., 2003] 38