Tehnici de colorare histologică ca instrumente de analiză a alimentelor Posibilități și limite
1 atelier de histologie alimentară/56 de atelier de igienă alimentară GAP Tehnici de colorare histologică ca instrumente în inspecția alimentelor Posibilități și limite Persoană de contact: Alexandra Bartholomä Sfaturi și evaluări Tel.: +49 (2151) Fax: +49 (2151) Biroul de investigații chimice și veterinare Rhein-Ruhr-Wupper AöR, Pagina 1 Deutscher Ring 100, Krefeld Internet:
2 Metode de rutină pentru examinarea histologică a produselor alimentare Colectarea oficială a metodelor de examinare (ASU) conform 35 LMBG L (decembrie 1989) Determinarea compoziției tisulare a cărnii, a produselor din carne și a produselor din mezeluri Metode de rutină pentru examenul histologic calitativ și cantitativ Termen: Sub compoziția substanțială a țesutului a produselor din carne a înțeles suma părților procesate de animale sacrificate sau ucise cu sânge cald. Celulele identificabile de origine vegetală pot fi, de asemenea, incluse în constatările cu privire la natura substanțială. Pagina 2
3 metode de colorare conform ASU L pagina 3
4 Alte metode de colorare pagina 4
5 Principiul colorării Calleja: cu picroindigo carmin ca colorare cu plasmă, diferite componente ale țesuturilor sunt colorate diferit; colorarea nucleului se face cu roșu rapid nuclear Evaluare: nuclee celulare: roșiatic-maroniu (colorare nucleară intensă greu accesibilă) Muschii încălziți: verde deschis, nu încălzit: verde puternic până la verde închis parenchim mare, alte țesuturi: (deschis) colagen verde țesut conjunctiv încălzit: albastru pal, neîncălzit: albastru țesut conjunctiv elastic: cartilaj galben, oase: albastru pagina 5
6 colorare Calleja-Lugol = combinație de colorare Calleja și colorare Lugol Utilizare în produse care conțin carbohidrați (de ex. Chifteluțe) Utilizare în probe care au un aspect macroscopic pozitiv pentru principiul Lugol: în plus, carbohidrații (în special amidonul nativ) sunt detectați în Lugol Iodul conținut în soluție este depus în spiralele elicoidale ale carbohidraților și le afișează în albastru și negru pentru a face diferența între amidon și carbohidrați structurați similar cu -1,4-legătură de la alți carbohidrați, un tratament cu amilază poate fi efectuat pe tăieturi paralele înainte de vopsire (0, Soluție 5% de amilază în tampon fosfat peste 2 ore) (istoric: probă de salivă) tratamentul cu amilază servește la verificarea rezistenței secțiunilor paralele tratate cu amilază care conține amidon, structurile acoperite anterior de grosimea albastru-negru pot fi evaluate pagina 6
7 colorare Calleja (Lugol) Evaluare: organele și țesuturile sunt prezentate ca în colorarea Calleja, în plus, glucidele cu - helice sunt colorate de maro până la negru Rezultatul după tratamentul cu amilază: Amidonul și carbohidrații structurați similar cu un compus -1,4 nu sunt detectabili sau nu sunt afișate la pagina 7
8 Opțiuni de colorare Calleja (Lugol): prezentare generală și colorare diferențială! evaluare cantitativă prin examinare suplimentară pentru multe țesuturi/organe (nu ficat!) posibilă identificare și determinare (semi) cantitativă a cantităților de: mușchi scheletici, cardiaci și ai limbii (inclusiv gradul de mărunțire) țesut conjunctiv (țesut conjunctiv colagen/elastic) țesut osos, țesut cartilagin, vase, Țesut glandular, țesut limfatic, țesut nervos, membrană mucoasă cutanată ficat, rinichi, plămâni și alte măruntaiele procesate din carne de cârnați cu și fără carcasă (rezultate fals negative posibile) componente ale plantei (de exemplu condimente, trufe) protecția grupurilor de celule vegetale prin microscop polarizant
9 Colorare Calleja (Lugol) Posibilități: Indicarea prezenței aditivilor non-carne Diferențierea materiei prime și încălzite Detectarea amidonului și a carbohidraților analogi cu legătură -1,4- (numai colorarea Calleja-Lugol) Indicarea prezenței carbohidraților în colorarea Calleja-Lugol dacă structurile rămân colorate după tratamentul amilazei pagina 9
10 Colorarea Calleja (Lugol) Limite: în funcție de gradul de încălzire, nucleele celulare nu sunt uneori afișate în mod optim Carbohidrații nu sunt evidențiați în colorarea Calleja. Cu colorarea Calleja-Lugol, detectarea KH este legată de o anumită structură a moleculei KH. Pagina 10
11 Calleja (Lugol) cârnați de limbă de colorat 25x pagina 11
12 Calleja (Lugol) cârnați de limbă de colorat 100x pagina 12
13 Calleja (Lugol) colorarea cârnaților fierți 25x pagina 13
14 Calleja (Lugol) colorat cârnați gătiti 100x pagina 14
15 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților fierți 25x pagina 15
16 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților fierți 100x pagina 16
17 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților crudi 25x pagina 17
18 Calleja (Lugol) colorat cârnați crudi 100x pagina 18
19 Calleja (Lugol) colorare salam gătit 100x pagina 19
20 Calleja (Lugol) colorare salam gătit 100x pagina 20
21 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților roșii 25x pagina 21
22 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților fierți 100x pagina 22
23 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților fierți 100x pagina 23
24 Calleja (Lugol) colorat carne de pasăre cârnați 100x pagina 24
25 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților de ficat 25x pagina 25
26 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților fierți 25x pagina 26
27 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților fierți 100x pagina 27
28 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților fierți (Wiener) 100x pagina 28
29 Calleja (Lugol) colorare a cârnaților fierți (Wiener) 100x pagina 29
30 Colorare hematoxilin-eozină (HE) Prezentare generală colorare denumită adesea colorare hemalum-eozină Principiu: Structurile de organe pot fi diferențiate prin colorarea nucleilor celulari cu hematoxilină și citoplasma cu eozină Evaluare: nuclei celulari: albastru-violet Citoplasmă: roz pagina 30
31 Colorare hematoxilin-eozină (HE) Posibilități: Constatări suspecte făcute cu pata Calleja (de exemplu dovezi ale inimii, ficatului, rinichilor, plămânilor, membranei mucoase cutanate, pielii păsărilor de curte, coaja) pot fi verificate deoarece contrastul dintre nucleele celulare și citoplasma. Limite: în comparație Pentru colorarea Calleja, țesutul conjunctiv și mușchii sunt mai dificil de diferențiat și cuantificat din cauza lipsei contrastelor de culori Carbohidrații nu sunt evidențiați Utilizarea de rutină în paralel cu colorarea Calleja nu este necesară pagina 31
32 Colorarea hematoxilin-eozinei (HE) colorată cu Liverwurst 100x pagina 32
33 Impregnarea azotatului de argint conform colorării diferențiale Kossa pentru detectarea țesutului osos Principiu: calciu legat în carbonați și fosfați este schimbat cu ioni de argint prin adăugarea de pirogalol și permanganat de potasiu, compusul de argint este redus la argint metalic, concentrațiile semnificative de calciu sunt legate numai în oase, oricare altele Ionii de calciu solubili sunt spălați în timpul pretratării secțiunilor Evaluare: Particule osoase: negru Citoplasmă: roșu-maroniu Nuclei celulari: roșu pagina 33
34 Impregnarea azotatului de argint conform cârnaților fierți Kossa 100x pagina 34
35 Colorare cu tricrom conform Pfeiffer, Wellhäuser și Gehra - colorare cu Alizarin S Colorare diferențială pentru detectarea calitativă și cantitativă a particulelor osoase mineralizate Principiu: os mineralizat înseamnă material osos care conține calciu (hidroxiapatită) cu un pH de 4,3-4,5 calciul osului (și, de asemenea, alți cationi divalenți (Mg, Al)) și alizarina S, un compus chelat galben-roșu aprins (lac colorat) protecție (nedescris în ASU): colorare suplimentară a unei secțiuni decalcificate anterior cu 5% acid azotic din același material Particulele osoase capătă culoarea albastră a restului țesutului din secțiunea decalcificată, cu morfologia păstrată, deoarece calciul a fost dizolvat. Numărarea particulelor osoase (nedescrisă în ASU): 10 secțiuni sau aproximativ 40 cm² sunt examinate pentru numărare cantitativă (Bijker și colab., 1984 ) Pagina 35
36 Colorare cu tricrom conform Pfeiffer, Wellhäuser și Gehra - colorare cu Alizarin S Evaluare: Oase: roșu Cartilaj: albastru Muschii și țesutul conjunctiv: albastru Rezultatul după tratamentul cu acid azotic: Muschii, țesutul conjunctiv, oasele demineralizate: albastru Peștera: îndepărtarea particulelor osoase în timpul pregătirii preparatelor, de ex. Particulele osoase foarte mari pot fi împinse afară din tăietură la tăiere, un spațiu rămâne vizibil în tăietură Demineralizarea particulelor osoase (de exemplu, prin depozitare mai lungă de formalină) Prin urmare, conținutul osos nu poate fi supraestimat, ci subestimat pagina 36
37 Colorare cu tricrom conform Pfeiffer, Wellhäuser și Gehra - cârnați de pasăre colorare Alizarin S 25x pagina 37
38 Colorare cu tricrom conform Pfeiffer, Wellhäuser și Gehra - cârnați de pasăre de colorare Alizarin S 100x pagina 38
39 Colorare cu tricrom conform colorării diferențiale Charvat pentru detectarea cârnaților opărați reprocesați Principiu: culoarea identifică particulele de fum (în carcasă și carnea de cârnați dedesubt). Culoarea arată suprafața cârnaților schimbată după fumat și țesutul atașat direct la acesta Părți rămase din preparat: particulele cenușii-verzi de cârnați prelucrate sunt de obicei mai compactate datorită încălzirii de două ori și nu sunt complet integrate în carnea de cârnați, cu cât materialul reprocesat este mai mărunțit, cu atât este mai dificil de detectat pagina 39
40 Colorare tricromă conform Charvat Posibilități: În funcție de intensitatea fumatului, este afișat un strat de roșu portocaliu de μm lățit. Evidența fumatului poate fi efectuată și după îndepărtarea carcasei (pielea decojită) Limite: pielea naturală nefumată (cârnați fierți, cârnați curry) nu poate fi prezentată Datorită grosimii sale mai mari și a incluziunilor existente în colorația Grocott (negru) sau în polarizarea luminii transmise (culori spectrale), particulele de cârnați fierte reprocesate pot fi recunoscute și în culoarea Calleja sau Calleja-Lugol datorită structurii compactate și a culorii verzi mai intense! Pagina 40
41 Colorare tricromă conform cârnaților fierți Charvat 100x pagina 41
42 Colorare tricromă conform cârnaților fierți Charvat 200x pagina 42
43 Calleja Lugol colorarea cârnaților fierți 25x pagina 43
44 Colorarea Grokott Colorarea diferențială Impregnarea cu argint este utilizată pentru a detecta carbohidrații cu 1,2 grupări diol, de ex. În agenții de îngroșare, preparatele de proteine vegetale și intestinele naturale, preparatele de proteine vegetale conțin reziduuri ale componentelor peretelui celular (carbohidrați), care sunt vizibile ca incluziuni în particulele de proteine datorită colorării Grokott (Grupuri 1,2-diol) acestea vin de ex. în amidon, făină de guar, făină de roșcove, agar, alginat, xantan și derivați de celuloză în fața grupelor hidroxil sunt oxidați în aldehide cu acid cromic aceste grupări aldehide reduc azotatul de argint și sunt prezentate maro-negru și apoi tonifiate cu clorură de aur pagina 44
45 Pete speciale: colorare Grokott Evaluare: Carbohidrați (KH): negru Muschii: roz Țesut conjunctiv: roz Proteine vegetale: roz atunci când există dovezi de legume, adică Particule de proteine care conțin carbohidrați, carbohidrații de culoare neagră sunt depozitați în particulele de proteină de culoare roz, cu cât proteinele vegetale sunt mai purificate, cu atât sunt mai puțini carbohidrați prezenți și detectabili. Tăieri paralele se efectuează un tratament cu amilază înainte de vopsire Rezultatul după tratamentul cu amilază Amidonul și carbohidrații structurați în mod similar cu legătură α-1,4 nu sunt detectabili pagina 45
46 Colorare Grokott Posibilități: Detectarea făinurilor vegetale și a preparatelor proteice bogate în proteine Preparate proteice vegetale: soia, semințe de bumbac, lupini, rapiță, floarea soarelui, grâu, porumb, linte, fasole Criterii morfologice: Făină: Palisadă și celule de sticlă de ceas din făină de soia TVP - structură spongioasă a glutenului de grâu, tip buclă de proteine din soia Limite: hidrolizate nedetectabile tipul de proteină vegetală nu poate fi determinat, morfologia oferă indicii despre originea pag. 46
47 Cârnați fierți de culoare Grokott (Wiener) 200x pagina 47
48 Bauer-Calleja-F./Nave cu acid periodic Reganz-F. (PAS) colorare diferențială Ambele coloranți servesc la detectarea carbohidraților cu 1,2 grupări diol în preparatele de proteine vegetale TVP conțin reziduuri ale componentelor peretelui celular (carbohidrați) care sunt vizibile ca incluziuni în particulele de proteine. Colorarea Bauer-Calleja se efectuează conform ASU cu o oxidare de acid crom: colorantul se leagă de 2 grupări aldehide libere adiacente, alternativ acidul periodic mai puțin agresiv poate fi utilizat pentru oxidare (= colorare PAS) Principiu: sunt detectate polizaharide în care există două grupări hidroxil pe atomii de carbon direct adiacenți (1,2 grupări diol) vino de ex. în amidon, făină de guar, făină de roșcove, agar, alginat, xantan și derivați de celuloză în fața grupărilor hidroxil sunt oxidați în aldehide cu acid cromic (colorare Bauer-Calleja) sau acid periodic (PAS) pagina 48
49 Bauer-Calleja-F./Nave cu acid periodic Reganz-F. (PAS) Evaluare: Carbohidrați: mușchi roșu-violet: țesut conjunctiv elastic verde: colagen galben. Țesut conjunctiv, cartilaj, oase: proteină vegetală albastră pal: tratament amilază verde pentru diferențierea amidonului și carbohidrați structurați în mod similar cu - 1,4-legătură de alți carbohidrați, un tratament amilază poate fi efectuat pe secțiuni paralele înainte de vopsire. Rezultatul după tratamentul amilazei amidon și carbohidrați structurați analog cu -1,4-linkage sunt posibilități și limite nedetectabile: ca și în cazul paginii de colorat Grokott 49
50 nave periodice cu acid Reganz-F. (PAS) cârnați fierți (vienez polonez) 200x pagina 50
51 Concluzii determinarea compoziției țesuturilor produselor din carne și a cârnaților a câștigat din nou importanță în ultimii ani, nu poate fi înlocuită cu metode analitice moderne, ca metodă de detectare directă în multe întrebări, este indispensabilă pentru determinarea componentelor relevante pentru calitate, reducătoare de calitate și interzise și declarabile permite diferențierea, identificarea și cuantificarea ingredientelor utilizate și oferă informații despre tehnologia de producție. Abaterile de la percepția generală pot rezulta din utilizarea țesuturilor neobișnuite, un grad crescut de mărunțire sau cantitatea de proteine musculare eliberate sau adăugarea de carne refăcută pagina 51
52 Concluzii Adăugările de ingrediente care nu sunt din carne, cum ar fi preparatele de proteine vegetale, agenții de îngroșare, hidrolizatele de țesut conjunctiv cu molecule ridicate sau fibrele vegetale, care necesită o declarație sau nu sunt permise în funcție de produs, sunt detectate folosind culori speciale. Comercializare suficientă! Pagina 52
53 Mulțumesc pentru atenție! Persoana de contact: Alexandra Bartholomä Consultanță și evaluare Tel.: +49 (2151) Fax: +49 (2151) Biroul de investigații chimice și veterinare Rhein-Ruhr-Wupper AöR, pagina 53 Deutscher Ring 100, Krefeld Internet: