Traumatism cerebral acut la șoareci urmat de protocolul longitudinal de imagini cu doi fotoni (tradus în
rezumat
Trauma cerebrală acută este o leziune gravă care nu a primit până acum un tratament adecvat. Microscopia multiphoton permite studierea longitudinală a procesului de dezvoltare a traumei cerebrale acute și investigarea strategiilor terapeutice la rozătoare. Două modele de traume cerebrale acute studiate folosind imagini in vivo cu doi fotoni ale creierului sunt demonstrate în acest protocol.
Abstract
Introducere
Leziunile cerebrale acute sunt o problemă semnificativă de sănătate publică, cu o incidență ridicată a leziunilor în accidente auto, căderi sau jafuri și prevalență ridicată a dizabilității sechelelor cronice. Abordările terapeutice pentru tratarea leziunilor cerebrale rămân în întregime simptomatice, limitând astfel eficacitatea îngrijirii preclinice, chirurgicale și critice. Acest lucru face ca efectele sociale și economice ale leziunilor cerebrale să fie deosebit de severe. Din mai multe motive, majoritatea studiilor clinice nu au reușit să demonstreze îmbunătățirea recuperării după afectarea creierului folosind noi abordări terapeutice.
Modelele animale sunt esențiale pentru dezvoltarea de noi strategii terapeutice pentru o fază în care eficacitatea medicamentului este prezisă la pacienții cu leziuni cerebrale. În prezent există mai multe modele animale stabilite de leziuni ale capului, inclusiv un impact cortical controlat 2, leziune prin percuție fluidă 2, deformare corticală dinamică 3, scădere în greutate 4 și leziuni foto. O serie de modele experimentale au fost utilizate pentru a studia anumite aspecte morfologice, moleculare și comportamentale ale patologiei asociate traumatismului cranian. Cu toate acestea, niciun singur model animal nu are succes în validarea noilor strategii terapeutice. Dezvoltarea unor modele animale fiabile, reproductibile și controlate ale leziunilor cerebrale este necesară pentru a evalua procesele patologice complexe.
Aici ne propunem să studiem metoda înțepăturii stereotactice cu un ac de seringă, care ar putea fi combinată cu aplicarea simultană a medicamentelor topice, ca model avansat pentru leziunile cerebrale locale și ca instrument pentru a studia consecințele fiziopatologice ale traumei acute în creierul mamiferelor in vivo.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Toate procedurile prezentate aici au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare locale pentru îngrijirea animalelor (Legea finlandeză privind experimentele pe animale 62/2006). Licența pentru animale (ESAVI/2857/04.10.03/2012) a fost obținută de la autoritatea locală (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Șoarecii adulți în vârstă de 1-3 luni, cu o greutate de 24-38 g, au fost ținuți în cuști individuale în unitatea universitară certificată și au primit hrană și apă ad libitum.
1. Leziuni cerebrale Imagistica printr-o fereastră a creierului
2. Leziuni cerebrale Imagistica prin craniul subțiat
Creați un diametru de la 0,5 la 1,5 mm. Îndepărtați fragmentele osoase cu aer comprimat în timpul găuririi Efectuați găurirea intermitent în timpul procedurii de subțiere pentru a evita supraîncălzirea prin frecare. Se răcește burghiul cu soluția la temperatura camerei și se aplică în mod regulat tampon pe zona diluată pentru a absorbi căldura.
NOTĂ: Pentru a evita deteriorarea scoarței, nu găuriți pe suprafețe mari (> 1,5 mm), cu excepția unui strat subțire (abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
1) fereastră cronică a creierului și 2) subțierea craniului, pentru imagistica cerebrală post-traumatică la șoareci transgenici: Am optimizat două procese operaționale. Există o reprezentare schematică a produselor de investigație Fig. 1 afișate. Înțepați traumatic printr-un ac de oțel cu diametrul exterior de 0,3 mm (30 G) la sondă (Figura 1A) deranjat. O pregătire reușită a ferestrei craniului permite realizarea de imagini la adâncimi de până la 650 µm sub suprafața pia (Figura 1B), în timp ce subțierea craniului tinde să aibă o limită de aproximativ 300 µm (1C) impune, ca și în reconstrucția 3D, celule piramidale corticale H de șoarece H-1-YFP-rezistente.
Traumatismul înțepător are ca rezultat eliminarea dendritelor și distrugerea rețelelor capilare într-un volum controlat al cortexului cerebral. În primele două zile, zona leziunii a crescut și trauma a indus vezicule dendritice și formarea bulbilor de retracție dendritică în zonele de perilie, așa cum s-a indicat folosind microscopia multiphoton in vivo (Fig. 2) observat.
Am efectuat activarea imaginii craniului Forst și migrarea șoarecilor microgliali CX3CR1-EGFP imediat după rănire (Figura 3A). Imaginea SHG oferă un instrument valoros pentru a identifica locul leziunii (3B) a delimita. Moleculele matricei extracelulare care generează semnale SHG sunt foarte îmbogățite în parenchimul creierului la traumatismul înțepător. În primul rând, se apelează micro procesele fine, apoi celulele microglia migrează la marginea locului de leziune (Figura 3A).
Pentru a evalua posibilele leziuni induse de introducerea pipetei de sticlă subțire și livrarea colorantului, efectuăm experimente in vivo cu microscopie cu doi fotoni cu microinjecție cu sulforodamină 101 la șoareci Thy1-YFP-H fără traume cerebrale. În Fig. 4 Imaginile reprezentative prezentate arată locul microinjecției la 3 ore după injectare. Urma inserării pipetei în meningi de către SHG (4A) recunoaște vizualizat. Astrocite cu sulforodamină 101 prin injecție (Fig. 4B) introdus marcat. Sub promotorul Thy1, dendritele YFP nu exprimă semne morfologice de rănire, cum ar fi vezicule sau ruperea becurilor (Figura 4 C) a demonstra.
Figura 4. Examinarea încărcării țesutului realizată prin soluție injectabilă printr-o micropipetă de sticlă. A. O urmă (prezentată cu linie punctată) în vizualizarea SHG a meningelor la 3 ore după injectare. B. Astrocite marcate cu sulforodamină introduse prin injecție. C. Dendritele exprimă YFP sub promotorii Thy1. D. Imagine combinată a A. (SHG - gri), B. (Astrocite - roșu), C. (dendrite neuronale - galbene).
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
Trauma cerebrală este un eveniment brusc, imprevizibil. Aici, descriem modelul animal care reproduce un spectru de sânge la pacienții umani după leziuni cerebrale, cum ar fi neurodegenerarea, eliminarea dendritelor, edemul creierului, cicatrici gliale, hemoragii în cortexul cerebral asociate cu hemoragia focală subarahnoidă și permeabilitatea crescută a modificărilor patologice observate -Bariera cerebrala. Pentru a studia patogeneza primară și secundară, precum și recuperarea după traume, acest model de leziune a fost combinat cu vizualizarea longitudinală in vivo a structurilor neuronale și gliale fine. Au fost utilizate linii transgenice de șoarece care exprimă proteinele fluorescente microglia (CX3CR1-EGFP) 9 în neuroni (Thy1-YFP-H) 7, astrocite (GFAP-EGFP) 8 sau. În plus, am folosit imagistica generării a doua a armonicilor (SHG) și încărcarea astrocitelor cu Sulfarhodamine 101 10.
Modelul descris aici recapitulează tipul de penetrare a leziunilor cerebrale. Prin urmare, o limitare a prezentului model constă în faptul că acesta nu oferă informații cu privire la mecanismele leziunii închise a capului. Recent, Schwert și coautorii au raportat rezultate imagistice multiphotonice asupra comportamentului celular în cortexul pericontuzional 6. Ținând cont de faptul că leziunea închisă a capului este un caz medical obișnuit, abordarea metodologică raportată de autori este foarte promițătoare pentru metodele tradiționale de cercetare în domeniul efectelor asupra creierului. Suplimentul Trauma 11.
Am folosit atât ferestrele cronice ale craniului 12, cât și preparatele pentru subțierea craniului 13 pentru a studia comportamentul celulei în condiții post-traumatice din creierul viu. Ambele metode au anumite avantaje și limitări. Astfel, fereastra cronică a creierului oferă o rezoluție mai bună, o adâncime optică îmbunătățită de penetrare în țesutul cerebral și confort pentru mai multe unități de imagistică. Dimpotrivă, este mai puțin probabil să inducă inflamație în locul de imagistică a subțierii craniului și, poate mai important, permite aplicarea repetată a medicamentelor și a coloranților. Câteva exemple de agenți farmacologici care trebuie utilizați în acest tip de experiment se află în tabelul 1 specificat.
Tabelul 1. Agenți farmacologici și coloranți pentru injecție în modelul de leziune a lancei corticale.
O gamă largă de evenimente biochimice, care sunt foarte importante în condiții fiziologice și patologice, pot fi testate cu inhibitori chimici, indicatori fluorescenți și proteine mutante introduse prin construcții virale. Avantajele alegerii unor ferestre de timp specifice oferite de preparatul pentru subțierea craniului pot fi foarte relevante pentru aceste studii.
În prezentul studiu am generat al doilea semnal armonic pentru a delimita locul leziunii. Alternativ, limitele locului de vătămare ar putea fi indicate printr-un colorant fluorescent slab împrăștiat, de exemplu un conjugat fluorescent dextran cu greutate moleculară mare (2 milioane daltoni).
Recent, Schaffer și colegii 14 au folosit o fereastră cronică de redeschidere cu craniu pentru re-livrarea coloranților fluorescenți pe cortexul mouse-ului. Este probabil ca redeschiderea ferestrei craniului să afecteze negativ transparența țesutului cerebral. În plus, este dificil să se prevadă cursul de timp al inflamației induse de recaptare, care poate afecta regenerarea țesutului conjunctiv.
Un avantaj major al fabricării craniului subțiat este capacitatea de a furniza compuși terapeutici (și alte materiale care necesită injecție topică în țesutul cerebral) de mai multe ori în timpul progresului traumei, fără a complica artefacte (de exemplu, fără reluarea ferestrei creierului).
În cazurile care nu necesită acces direct la zona rănită, vă recomandăm să diluați zona subțiată a craniului cu o lamă de acoperire din sticlă, așa cum este descris în hârtia și oțelul pe pregătirea craniului lustruit de Kleinfeld și colegii săi 15. Acest lucru se poate face cu următoarele proceduri opționale. Puneți o picătură mică de agaroză (1,5%) pe regiunea subțire a craniului, așteptați să se gelifice, îndepărtați orice agaroză inutilă, așa că lăsați-o pe locul accidentării. Agaroza ar trebui să protejeze locul rănirii de influențe externe. Uscați vârful subțiat al capului cu aer comprimat. Lăsați o cantitate mică de adeziv poliacrilic pe o bucată mică de alunecare de acoperire # 0 și așezați-o pe regiunea subțire a craniului. Adezivul previne regenerarea oaselor poliacrilice și a țesutului conjunctiv și astfel păstrează craniul subțiat conservat sub fereastră.
O combinație a acestor proceduri permite studierea proceselor post-traumatice acute și cronice și eliberează medicamente local sau sistemic și monitorizează direct efectele tratamentului. Utilizarea liniilor de șoarece transgenice duale sau triple poate fi, de asemenea, utilă, în special, pentru afișarea simultană a mai multor procese post-traumatice, cum ar fi cicatrizarea celulelor gliale și creșterea ramurilor neuronale. Ne așteptăm ca modelele noastre de leziuni cerebrale acute examinate folosind microscopia intravitală cu doi fotoni pentru a se dovedi fructuoase pentru testarea candidatului la medicamente.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Dezvăluiri
Autorii nu au nimic de dezvăluit.
Mulțumiri
Suntem profund recunoscători că Dr. Frank Kirchhoff pentru furnizarea de tulpini de șoarece GFAP-EGFP și CX3CR1-EGFP. Lucrarea a fost susținută de subvenții de la Centrul pentru mobilitate internațională din Finlanda, Tekes, Școala finlandeză de absolvenți de neuroștiințe (FGSN) și Academia din Finlanda.