Un model de inoculare întârziată a protocolului de infectare a plăgii cronice cu Pseudomonas aeruginosa

rezumat

Descriem un protocol de inoculare întârziat pentru a produce infecții cronice ale plăgilor la șoareci imunocompetenți.

Abstract

Introducere

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) este o bacterie Gram-negativă în formă de tijă cu o relevanță crescândă pentru sănătatea și boala umană. Este responsabil pentru morbiditatea și mortalitatea extinse în medii nosocomiale, în special implicând infecții ale plăgilor la pacienții imunocompromiși 1, 2. Apariția tulpinilor multirezistente ale acestui agent patogen a oferit un impuls suplimentar pentru investigarea factorilor care contribuie la virulența P. aeruginosa, a mecanismelor de rezistență la antibiotice ale P. aeruginosa și a noilor metode de prevenire. infecție 3. Ca atare, nevoia de modele animale de infecție cronică a rănilor ca instrumente pentru studierea acestor întrebări de cercetare nu a fost niciodată mai mare.

Din păcate, multe modele animale de infecție cu P. aeruginosa tind să imite infecția acută cu rezolvarea rapidă a infecției sau declinul rapid datorat sepsisului 4, 5, care nu imită în mod adecvat natura adesea cronică a acestor infecții. Pentru a depăși acest dezavantaj, unele modele utilizează implantarea de corpuri străine, cum ar fi mărgele de agar, implanturi de silicon sau geluri de alginat 6, 7, 8. Alte modele folosesc șoareci imunocompromiși din cauza vârstei înaintate, obezității sau diabetului sau prin mijloace farmacologice, cum ar fi neutropenia 9, 10, 11, 12 indusă de ciclofofosfamidă. Cu toate acestea, utilizarea materialelor străine sau a gazdelor imunocompromise probabil modifică procesul inflamator local, făcând dificilă obținerea unei înțelegeri a fiziopatologiei implicate în infecțiile cronice ale rănilor la gazde cu sisteme imune altfel normale.

Am dezvoltat un model cronic de infecție a plăgii P. aeruginosa la șoareci care implică inocularea întârziată cu bacterii după leziuni excizionale. Inocularea întârziată permite experimentele de evaluare a încărcăturii bacteriene care se extind până la cel puțin 7 zile. Acest model deschide noi posibilități de a studia atât patogeneza, cât și noile tratamente ale infecțiilor cronice cu P. aeruginosa.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate metodele descrise aici au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Universității Stanford.

1. Pregătirea și creșterea bacteriilor

  1. Efectuați toate lucrările cu P. aeruginosa și animalele cu măsuri de precauție BSL-2 în conformitate cu ghidurile Comitetului instituțional pentru biosecuritate și ale Comitetului pentru utilizarea animalelor. Efectuați toți pașii descriși aici care implică P. aeruginosa, inclusiv inocularea șoarecilor, într-un cabinet de biosecuritate.
  2. Tulpina luminiscentă PAO1: lux a P. aeruginosa este disponibilă la cerere în laboratorul nostru. Stria PAO1, stocată ca stoc de glicerol înghețat, pe agar Lysogeny Broth (LB). Pentru tulpina luminiscentă PAO1: lux, agar LB trebuie să conțină antibiotice selective (100 'g/ml carbenicilină și 12,5' g/ml kanamicină). Creșteți la 37oC peste noapte într-un incubator bacterian.
  3. Alegeți o colonie izolată și creșteți peste noapte la 37 ° C în 3 ml lb mediu, pH 7,4. Pentru tulpinile luminescente, bulionul trebuie să conțină 100 og/ml carbenicilină. Creșteți în condiții aerobe agitate.

2. Pregătirea procedurii

  1. Puneți toți angajații care efectuează operația să poarte o halat/halat de laborator curat, mască de față, plasă de păr și mănuși.
  2. Autoclavează toate instrumentele chirurgicale, inclusiv foarfecele și forcepsele. Folosiți tehnica aseptică pentru a steriliza instrumentele între animale.
  3. Curățați masa chirurgicală cu etanol și pregătiți o pânză chirurgicală curată.

3. Îndepărtarea părului

4. Chirurgie excisională a plăgii cu grosime completă

5. Inocularea cu P. aeruginosa

6. Imagistica in vivo a rănilor infectate

7. Managementul postoperator

  1. Monitorizați șoarecii în conformitate cu liniile directoare stabilite de protocolul IACUC al cercetătorului. Monitorizăm zilnic toți șoarecii în primele 4 zile, apoi în fiecare zi până la sfârșitul experimentului. Se cântăresc șoarecii o dată pe zi în primele 4 zile după operație într-un BSC. Se injectează 250 l de clorură de sodiu 0,9% subcutanat în zilele 1 și 2 după infecție.
  2. Verificați dacă există semne de durere/suferință la șoareci, incluzând postura încovoiată, haina scruffy, letargie, dificultăți de respirație, grimase faciale și pierderea în greutate.
  3. Dacă animalele prezintă semne de deteriorare a sănătății, consultați un medic veterinar. Orice șoarece care pare să prezinte semne de agravare a durerii/suferinței și a unei pierderi în greutate de 20% sau mai mult ar trebui eutanasiat.