Un model murin avansat pentru steatohepatita nealcoolică în asociere cu diabetul de tip 2
rezumat
Este descris un model simplu și fiabil de gardă indus de dietă pentru steatohepatita fără alcool (NASH), care se realizează prin adăpostirea non-SPF a animalelor și administrarea unei diete specifice bogate în grăsimi. Descriem identificarea subseturilor de celule hepatice și grase pentru a recapitula condițiile imune umane prin expunerea șoarecilor la germeni din mediu.
Abstract
Obezitatea a fost legată de inflamația cronică, de grad scăzut și rezistența la insulină, ceea ce contribuie la o prevalență crescândă a bolilor metabolice cronice, cum ar fi diabetul de tip 2 și steatohepatita fără alcool (NASH). Cercetări recente au arătat că celulele imune antiinflamatorii se infiltrează în țesutul adipos hipertrofic obez și ficat. Având în vedere rolul emergent al celulelor imune în homeostazia metabolică, este urgent să se cuantifice și să se caracterizeze schimbarea lor în dezvoltarea diabetului de tip 2 și a NASH. Cu toate acestea, modelele animale care evocă trăsături fiziopatologice tipice NASH uman sunt rare.
În acest articol, oferim un protocol detaliat pentru a identifica subseturi de celule imune izolate din ficat și țesutul adipos într-un model de șoarece de încredere de NASH obținut prin plasarea șoarecilor cu dietă bogată în grăsimi (HFD) sub nespecifici fără patogeni (SPF) fără blocare timp de cel puțin șapte săptămâni. Arătăm manipularea șoarecilor în condiții non-sărate, digestia țesutului și identificarea macrofagelor, celulelor ucigașe naturale (NK), celulelor dendritice, subseturilor de celule B și T prin citometrie de flux. Sunt furnizate graficele reprezentative de citometrie în flux de la șoareci SPF-HFD și șoareci non-SPF. Pentru a obține date fiabile și interpretabile, utilizarea anticorpilor, metodele precise și precise pentru digestia țesuturilor și tipul potrivit în experimentele de citometrie în flux sunt elemente cruciale.
Intervenția pentru restabilirea expunerii fiziologice la antigen la șoareci prin plasarea lor în condiții nonslave și expunerea nespecifică la antigeni microbieni ar putea fi un instrument relevant în studierea relației dintre modificările imunologice cauzate de dietă. Obezitatea și complicațiile asociate pe termen lung.
Introducere
Obezitatea este o boală multifactorială și un factor de risc major pentru apariția bolilor de inimă, accident vascular cerebral, steatohepatită fără alcool (NASH), diabet de tip 2 (T2D) și unele tipuri de cancer. Prevalența obezității crește rapid în întreaga lume. Astăzi, 2,1 miliarde de oameni - aproape 30% din populația lumii - sunt fie obezi, fie supraponderali.
Țesutul adipos este alcătuit din diferite tipuri de celule, inclusiv adipocite, celule endoteliale, fibroblaste și celule imune. În timpul progresiei obezității, modificările numărului și activității celulelor imune pot duce la inflamații inferioare ale țesutului adipos hipertrofic 3, 4. Mai exact, s-a constatat că aportul excesiv de energie, însoțit de niveluri cronice crescute de zahăr din sânge, trigliceride și acizi grași liberi, duc la hipoxie adipocitară, stres reticular endoplasmatic, afectarea funcției mitocondriale și creșterea secreției de citokine, ceea ce duce la activarea celulelor grase antiinflamatoare 5,6. Cercetările de până acum s-au concentrat în principal pe imunitatea înnăscută, dar mai recent, celulele imune adaptive (celulele T și B) au apărut ca regulatori importanți ai homeostaziei glucozei. Au funcții inflamatorii (inclusiv celule T CD8 +, celule Th1 și B) sau, mai ales, funcții de reglare (inclusiv celule T (Treg) reglatoare, celule Th2) și pot exacerba și proteja rezistența la insulină de 7,8 ., 9 septembrie
Pentru a studia diferitele subseturi de celule imune din țesutul adipos și ficat în dezvoltarea rezistenței la insulină și NASH într-un model avansat de șoarece care reproduce condițiile imune umane, șoarecii au fost plasați în cuști individuale în condiții semi-sterile fără barieră. Șoarecii care au fost adăpostiți în condiții de expunere la antigen au dezvoltat o patologie hepatică asemănătoare NASH după doar 15 săptămâni de dietă bogată în grăsimi (HFD). În comparație cu șoarecii SPF corespunzători vârstei, au dezvoltat steatoză macrovesiculară, infiltrare hepatică și activarea celulelor imune.
Acest manuscris descrie o analiză robustă de citometrie în flux pentru a defini și număra subseturi de celule imune din țesut adipos și ficat de șoarece într-un model de NASH. Analiza de citometrie în flux permite determinarea mai multor parametri ai celulelor individuale în același timp, spre deosebire de abordările RT-PCR sau imunohistochimie.
Pe scurt, studiul nostru oferă un model de șoarece de HFD pe termen scurt pentru a studia dezvoltarea rezistenței la insulină și a NASH și mecanismele de bază care prezintă, de asemenea, fidelitatea față de condiția umană.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Acest studiu a fost realizat în conformitate cu Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și Legea privind bunăstarea animalelor, sub supravegherea Comitetului instituțional pentru bunăstarea animalelor. Protocoalele animale au fost realizate în conformitate cu liniile directoare etice instituționale ale Charité Berlin și aprobate de Oficiul de Stat pentru Sănătate și Afaceri Sociale și corespund liniilor directoare ARRIVE.
1. Modelul animal de steatohepatită indus de dietă
2. Pregătirea reactivilor și a soluțiilor
A treia generație de suspensii monocelulare
5. Compensarea, achiziția și închiderea citometriei de flux
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
Rezultatele reprezentative ale colorării extracelulare a celulelor T în ficatul murin al șoarecilor expuși la HFD sunt prezentate în Figura 3 A detectat în comparație cu șoarecii HFD SPF. De fapt, un procent mai mare de efector stochează celule T CD4 + și CD8 + poate fi detectat la șoarecii expuși la HFD, în timp ce celulele T CD4 + și CD8 + naive intrahepatice au fost semnificativ mai mici la expunere comparativ cu șoarecii SPF. Săptămâna 7 (Figura 3 A).
Pentru a valida aceste rezultate, răspunsul inflamator hepatic asociat cu expunerea la antigen a fost examinat prin colorarea secțiunilor hepatice ale șoarecilor hrăniți timp de 15 săptămâni 13. Steatoza severă, inclusiv creșterea picăturilor lipidice mari care duc la steatoza macrovesică, inflamația lobeliei, balonarea hepatocelulară și lobulația perturbată, a fost găsită la șoarecii expuși la HFD, în timp ce doar unii șoareci SPF au prezentat o acumulare ușoară de grăsime în ficat (Figura 3B). Ca în figură3C a raportat, proporția celulelor NK în țesutul adipos perigonadal al șoarecilor expuși la HFD a fost mai mare, în timp ce șoarecii HFD-SPF au prezentat o proporție mai mare de celule dendritice. Nu s-au găsit diferențe semnificative pentru macrofage și monocite. În general, aceste rezultate confirmă steatoza hepatică mai severă la șoarecii expuși la HFD și diferențe mai mici în țesutul adipos între șoarecii expuși la HFD și SPF.
tabelul 1 prezintă anticorpii utilizați în tabelul 1. Anticorpii utilizați în analiza citometriei în flux pentru colorarea extraeculară a celulelor B, macrofage, celule NK, celule dendritice și granulocite sunt în masa 2afișate.
Imaginea 1 : Reprezentarea schematică a strategiei de gating folosită în analiza citometriei în flux a obezității (Tabelul 1). Mai întâi celulele sunt închise pe single. Apoi murdăria este eliminată folosind zona de împrăștiere înainte (FSC-A) și zona de împrăștiere laterală (SSC-A) și alegând dimensiunea potrivită. Celulele sunt, de asemenea, caracterizate prin expresia CD45. Celulele viabile sunt selectate cu marker de celule vii/moarte, un colorant de reacție amină care nu este destinat celulelor vii, dar este destinat celulelor cu membrane compromise. Celulele T au fost împărțite în celule T citotoxice (CD8 +) și celule T helper (CD4 +) și împărțite în naive (CD44 + CD62L-), stocare centrală (CD44 + CD62L +), stocare efectoră (CD44 + CD62L -) și celule T efector (CD44 - CD62L +). În cele din urmă, celulele CD44 + sunt închise pe KLRG1, CD127 și PD-1. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.
imaginea 2 : Reprezentarea schematică a strategiei de gating folosită în analiza citometriei în flux a celulelor adipoase (Panoul 2). Portarea celulelor dendritice sa bazat pe expresia CD11b și CD11c. Au fost definite următoarele alte populații: celule B, celule NK, macrofage, monocite și granulocite. Datele au fost analizate cu software-ul adecvat după achiziție. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.
poza 3 Figura: Analiza citometrică de flux reprezentativă a celulelor T izolate din țesutul adipos perigonadal murin și ficat. (A) Celulele T CD4 + și CD8 + din ficat murin de la 7 săptămâni de șoareci HFD ținute sub SPF și condiții expuse au fost analizate prin citometrie în flux. B.) colorare reprezentativă a 15 săptămâni de HFD SPF și șoareci expuși. Infiltrarea celulelor imune și a hepatocitelor din fibre dietetice (vârfuri de săgeți) ilustrează NASH. C.) Proporția celulelor imune înnăscute ale obezității ca procent de leucocite la șoarecii HFD ținuți sub SPF sau expuși condițiilor timp de 7 săptămâni. n = 6-10 șoareci per grup. Semnificația a fost determinată cu ajutorul măsurătorilor multiple ANOVA cu două căi. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. * * P & lt; 0,01, * * * P 13 modificat. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
Steatohepatita are o asociere puternică cu tulburări metabolice, cum ar fi obezitatea, rezistența la insulină și dislipidemia 15. Mai multe studii sugerează că inflamația țesutului adipos poate conduce la patogeneza diabetului de tip 2, incluzând modificarea numărului de celule atât în sistemul imunitar înnăscut cât și în cel adaptiv 4, 5, 16, 17. În plus, sa constatat că obezitatea modulează activarea căilor imune, ceea ce poate duce la complicații hepatice 18. Interesul pentru caracterizarea fenotipurilor de celule imune în obezitate și inflamația ficatului este în creștere, deoarece fiecare subpopulație de celule imune contribuie diferit la dezvoltarea rezistenței la insulină și a steatohepatitei.
Această metodă oferă informații detaliate despre modul de izolare și cuantificare a cantităților relative de celule imune din țesutul adipos perigonadal și ficat. În plus, metodele arată cum șoarecii hrăniți cu HFD pot fi păstrați în condiții non-sasheice pentru a induce steatohepatita. Protocolul poate fi utilizat pentru a studia funcțiile celulelor imune și pentru a studia conexiunile celulelor imune specifice între diferite țesuturi într-un mediu normalizat microbiologic.
În studiul nostru actual, HRFD care hrănește șoareci non-sepF a dus la dezvoltarea rezistenței la insulină și a steatohepatitei, în timp ce șoarecii HFD SPF au dezvoltat rezistență la insulină, steatoză hepatică ușoară, dar nu steatohepatită așa cum este determinată de imunohistochimie. În plus, subgrupurile de grăsime și mucegai hepatic au diferit semnificativ între șoarecii expuși la HFD și șoarecii SPF, ceea ce confirmă înțelegerea noastră despre importanța diferitelor condiții de viață. În concluzie, am putut arăta că expunerea microbiană la o comunitate ar putea afecta dramatic proprietățile imunologice ale șoarecilor C57Bl/6. Lucrările anterioare au arătat că diversitatea și funcția microbiomului intestinal sunt influențate de obezitatea legată de dietă 19, 20 și că funcția de barieră intestinală și permeabilitatea intestinală depind de condițiile de viață 21. Într-o publicație viitoare, dorim să abordăm relația dintre colonizarea intestinului și inflamația grăsimii și a ficatului.
Există mai multe puncte de luat în considerare atunci când planificați metodele propuse. În primul rând, toate testele de citometrie în flux necesită suspensii unicelulare, iar viabilitatea celulară poate fi afectată de gradul de disociere mecanică a țesutului și de durata digestiei țesuturilor. Pentru a evita distrugerea ebegitopului anticorpului și pentru a maximiza randamentul celulelor disociate viabile din punct de vedere funcțional, tipul de țesut, vârsta animalului, modificările genetice, concentrațiile de enzime, temperatura și timpii de incubație.
În al doilea rând, protocolul nostru a fost optimizat pentru a cuantifica diferite fenotipuri celulare de impact de la șoareci obezi hrăniți cu HFD cu inflamație a țesutului adipos și steatohepatită. Deoarece numărul de celule imune, numărul de celule imune și, prin urmare, calitatea digestiei țesuturilor, ar putea fi influențate de procese inflamatorii, protocolul utilizat și colagenaza ar trebui optimizate pentru alte țesuturi decât ficatul sau țesutul adipos în anumite experimente. În ceea ce privește metodele de disecție, timpii de incubație sau colagenaza utilizată pentru a digera țesutul. În al treilea rând, este important pentru protocol ca diferite grupuri experimentale să fie implicate zilnic pentru a elimina efectele variației zilnice a testului de citometrie în flux (temperatură, timpi de incubație etc.).
În cele din urmă, oferim un protocol detaliat pentru caracterizarea fenotipică a adipozei murine și a celulelor imune ale ficatului folosind citometrie de flux într-un model animal indus de dietă de NASH și rezistență la insulină. Având în vedere funcția complexă și reglarea celulelor înnăscute și adaptive asociate cu obezitatea și dereglarea metabolică, metodele noastre propuse ar trebui să ne ajute să aprofundăm înțelegerea mecanismelor imunologice pentru a echilibra homeostazia metabolică. Așadar, ajutați la dezvoltarea terapeuticii umane care pot restabili răspunsurile imune anti-inflamatorii. În general, modelul animal furnizat servește ca un model rapid și robust pentru evaluarea complicațiilor metabolice legate de obezitate și poate fi aplicat și altor modele de boală.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.