Un model uman 3D de cultură extracelulară cu matrice-adipocite pentru studierea metabolismului celular-matricial

rezumat

Descriem un sistem 3D de matrice-adipocite extracelulare om-om în vitro care permite descompunerea rolurilor matricei și adipocitelor în codiparea fenotipului metabolic al țesutului adipos.

Abstract

Introducere

Matricea extracelulară (ECM) nu numai că oferă un cadru mecanic pentru țesuturi, dar intervine și în conversația încrucișată complexă cu celulele care se află în ea și reglează diferite procese necesare pentru homeostazia țesuturilor, inclusiv proliferarea celulelor, diferențierea, Semnalizare și metabolism 1. În timp ce ECM sănătos joacă un rol esențial în menținerea funcției normale a țesuturilor, ECM disfuncțională a fost implicată în mai multe boli 2 .

Țesutul adipos joacă un rol important în patogeneza bolilor metabolice. Obezitatea este asociată cu hipertrofie adipocitară excesivă și hipoxie celulară, defecte în metabolismul celulelor adipocite și țesut adipos, mai mult reticul endoplasmatic și stres oxidativ și inflamație. Deși slab înțelese, aceste procese complexe conspiră pentru a compromite capacitatea de tamponare a țesutului adipos, rezultând în deversarea de nutrienți din țesutul adipos, toxicitate multi-țesut și boală metabolică sistemică 3, 4, 5. Succesiunea evenimentelor și mecanismele specifice care stau la baza insuficienței țesutului adipos sunt slab înțelese, dar au fost implicate modificări ale ECM ale țesutului adipos. Compoziția ECM este modificată în țesutul adipos la obezitatea umană și murină, cu depunerea crescută a proteinei ECM împreună cu diferențele calitative biochimice și structurale în ECM ale țesutului adipos asociate bolilor metabolice umane, inclusiv diabetul de tip 2 și hiperlipidemia 6, 7, 8, 9, 10, 11 .

În ciuda acestor observații, rolul ECM al țesutului adipos în medierea disfuncției țesutului adipos nu este bine definit. Acest lucru se datorează parțial lipsei unor modele experimentale robuste care să permită defalcarea rolurilor specifice ale ECM și adipocitelor în reglarea funcției adipoase finale. Cultura adipocitelor ECM simulează mediul in vivo al țesutului adipos nativ în cel puțin două puncte. În primul rând, cultura ECM oferă un mediu molecular care este similar cu țesutul adipos nativ, inclusiv colagenii nativi, elastinele și alte proteine ​​matrice care lipsesc în cultura 2D standard. În al doilea rând, s-a demonstrat că cultura pe plasticul 2D modifică metabolismul adipocitelor prin efecte mecanice datorită elasticității reduse a substratului plastic 12, care elimină cultura ECM.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Țesuturile obeze sunt procurate de la subiecți umani supuși unei intervenții chirurgicale bariatrice elective sub aprobarea instituției de examinare instituțională.

1. Izolarea preadipocitelor și prepararea reactivului de cultură

  1. Se prepară 2% albumină serică bovină (BSA) într-o soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Sterilizați filtrul și păstrați-l la 4 ° C.
  2. Pregătiți nasul de colagen de tip II: 2 mg/ml în 2% BSA în 1x PBS. Pregătiți imediat înainte de utilizare.
  3. Pregătiți soluția de lizare a globulelor roșii (RBC): 1,5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM disodic EDTA în apă deionizată (DI/H2O). A se păstra la 4 ° C. Pregătiți 1x soluție de lizat RBC din 10x soluție de stocare în DI/H2O imediat înainte de utilizare.
  4. Pregătiți mediu de creștere: 15% ser bovin fetal (FBS), 1% soluție antifungică (ABAM) în mediul Eagle modificat Dulbecco: amestec nutritiv F-12 (DMEM/F12). Sterilizați filtrul și păstrați-l la 4 ° C.
  5. Se prepară soluția de congelare a preadipocitelor: 10% dimetil sulfoxid, 15% FBS în mediu DMEM/F12. Sterilizați filtrul și păstrați-l la 4 ° C.
  6. Pregătirea mediilor de diferențiere: 10 mg/l transferină, 33 'M biotină, 0,5' M soluție de insulină umană, 17 'M sare hemicalcică acid D-pantotenic, 100 nM dexametazonă, 2 nM 3,3', 5-triiodo-L-tironină sare de sodiu (T3), 1 izobutil-1-metilxantină (IBMX), 1% ABAM în DMEM/F12. Sterilizați filtrul și păstrați-l la 4 ° C.

3. Prepararea reactivului de fenotipare metabolică

  1. Absorbția glucozei
    1. Pregătiți medii de înfometare serică: DMEM/F12, 1% ABAM. Sterilizați filtrul și păstrați-l la 4 ° C
    2. Pregătiți 200 nM soluție de insulină umană în 1x PBS imediat înainte de utilizare.
    3. Se prepară 200 nM insulină umană, 0,1 mM 2-deoxi-D-glucoză, 1 Ci/godeu deoxi-D-glucoză, 2- [1,2-3 H (N)] -, în 1x PBS. Pregătiți imediat înainte de utilizare.
  2. Lipoliza
    1. Se prepară izoproterenol diluat în PBS: soluție stoc 3 mM. Pentru test, diluați o concentrație de lucru de 3 m.
  3. Ulei de culoare roșu-O
    1. Se prepară 4% formalină în DI/H2O. La temperatura camerei.
    2. Pregătiți soluția de lucru Oil Red-O. Diluați soluția de ulei roșu-O (ORO) cu DI/H2O în raportul 3: 2 (ORO: DI/H2O). Pregătiți imediat înainte de utilizare. Filtrează prin hârtie de filtru (Tabel de materiale).

4. Achiziționarea țesutului adipos

NOTĂ: Țesutul adipos visceral (TVA) este îndepărtat din omentul mai mare de către chirurg la începutul operației și transportat înapoi la laborator pe gheață pentru prelucrare imediată. Precauții universale trebuie respectate atunci când se manipulează toate țesuturile umane și reactivii corozivi, inclusiv efectuarea tuturor lucrărilor într-o hotă laminată, folosind uzura completă de siguranță a laboratorului și fără recăderea acelor.

  1. Adăugați 5-10 g de taxe de vânzare intacte la 15-25 ml soluție tampon de congelare într-un tub conic de 50 ml pentru a scufunda proba de țesut. Depozitați probele la -80 ° C până la decelularizare timp de până la 1 lună.
  2. Utilizați o probă separată de cuvă proaspătă pentru izolarea prereadipocitelor, așa cum este descris în secțiunea 5.

6. Preparat ECM pentru țesut adipos

8. Fenotipare metabolică

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

model
Figura 1: Flux de lucru pentru prepararea adipocitelor ECM. Ziua 1: Probele de țesut adipos visceral întreg trec prin trei cicluri de îngheț-dezgheț, urmate de incubație nocturnă cu soluție digestivă enzimatică # 1. Ziua 2: După digestie cu soluția enzimatică # 1, probele sunt digerate cu soluția enzimatică de digestie # 2 peste noapte. În acest moment, probele sunt parțial delipidate. Ziua 3: După digestia enzimatică # 2, probele sunt incubate peste noapte cu o soluție de extracție a solventului polar care completează delipidarea. După ziua 3, probele ar trebui să fie complet delipidate și de culoare albă/translucidă. Probele sunt spălate bine cu soluție tampon de clătire, apoi 70% etanol și depozitate în soluție de depozitare la 40 ° C până când pot fi completate cu presipocite. Ziua 4: Preadipocitele sunt însămânțate în impozit pe vânzări decelularizat timp de 14 zile, urmate de diferențierea adipogenă. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

extracelulară
Figura 2: Flux de lucru pentru izolarea prereadipocitelor. Taxa de vânzare este mărunțită, digerată cu colagenază, filtrată, centrifugată, iar peleta de celule stromovasculară rezultată este placată cu aur și cultivată pentru a extinde presipocitele. Pentru mai multe informații despre izolarea presipocitelor umane și cultura adipocitelor 2D, consultați Baker și colab. 2017 21. Vă rugăm să faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

matrice-adipocite
Figura 3: Scanarea imaginilor de microscopie electronică. Țesutul adipos intact, țesutul adipos decelularizat și țesutul adipos decelularizat care a fost repopulat cu prepocite timp de 14 zile și diferențiat în medii adipogene. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Au fost publicate metode similare pentru izolarea ECM din țesutul adipos și însămânțarea cu presipocite, cu dovezi care sugerează că ECM poate promova diferențierea adipogenă fără mediatori adipogeni clasici, inclusiv agoniștii AMPc. Insulină și agoniști PPAR 12, 14. Datele noastre sunt primele care demonstrează reglarea specifică bolii a metabolismului celular de către ECM în țesutul adipos, folosind metode în care adipocitele sunt stimulate cu factori clasici de diferențiere adipogenă 11; studii similare fără stimuli adipogeni sunt un obiectiv al cercetărilor viitoare. Alții au un exces similar de celule ECM specifice bolii cu ECM și celule din țesutul pulmonar 19, 20. Au fost utilizate, de asemenea, strategii alternative, inclusiv crearea matricilor prin amestecarea preparatelor omogenizate de țesut adipos ECM în hidrogeluri peptidice 12 .

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Autorii nu declară interese conflictuale.