Un test de eflux bazat pe proteolipozomi pentru a determina proprietățile unei singure molecule ale canalelor Cl și
Introducere
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
1. Prepararea lipidelor
2. Formarea proteolipozomilor
NOTĂ: Mai multe strategii pot fi folosite pentru a introduce proteina solubilizată în detergent în lipozomi. Pentru CLC-ec1 dializa funcționează bine și, prin urmare, este metoda la alegere 6,9,10.
3. Înregistrați configurarea
NOTĂ: Înregistrarea este configurată (figura 2A) este format din două camere (cilindri cu fund plat,
3-4 ml volum), un electrod Cl - (vezi mai jos), un pHmetru cu ieșire electrică analogică sau digitală, un digitizator și un computer cu software de achiziție adecvat.
- Conectați electrodul Cl - pH-metru, ieșirea pH-metrului la digitalizatorul conectat la computer. Așezați electrodul de referință într-o cameră de recodare și firul în cealaltă (figura 2B).
NOTĂ: Polaritatea firelor este corectă dacă AV Cal (a se vedea pașii 6.4 și 7.2) este pozitivă. - Așezați camerele pe o placă de amestecare cu o bară de amestecare în camera de înregistrare (figura 1B). Asigurați-vă că bara de amestecare nu atinge electrodul.
- Conectați camerele folosind un pod de agar (figura 2B) (100 mM KCl și 2% agaroză). Păstrați podurile Agar în KCl 100 mM.
4. Pregătirea Cl - electrod
- Luați un electrod pH vechi și, posibil, nefuncțional. Rupeți acoperirea de sticlă pentru a dezvălui complet firele de argint.
- Îndepărtați cu atenție învelișul din firele de argint folosind o lamă de bisturiu. Curățați firele folosind cantități mari de H20 și EtOH.
- Se pune într-o soluție saturată de FeCl3 (sau înălbitor) până când firele sunt acoperite cu un strat uniform întunecat de AgCl.
5. Pregătirea veziculelor unilamelare
-
În noaptea dinaintea experimentelor, umflați 1 g de margele Sephadex G-50 în 15 ml de tampon extern (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM acid citric, pH 4,5) cu agitare ușoară. (Nu amestecați) timp de cel puțin trei ore la temperatura camerei înainte de utilizare. Fiecare experiență necesită
3 ml de margele umflate. Păstrați mărgelele umflate la 4 ° C cel mult câteva zile. În timp ce lipozomii se decongelează la temperatura camerei, se toarnă în fiecare coloană
3 ml de margele G-50 umflate. Lăsați-i să se usuce prin gravitație la temperatura camerei; durează de obicei 1-2 minute.
200 ft de scrisori de credit care vor fi adăugate la camera de înregistrare la pasul 6.5.
6. Măsurarea efluxului
- Așezați 2 ml KCl 100 mM în camera de referință (masă) și 1,8 ml tampon extern (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM acid citric la pH 4,5) la camera de înregistrare. Micul dezechilibru osmotic dintre soluțiile interne și externe nu afectează
- Porniți programul de achiziție. Lăsați echilibrul de bază, poate dura câteva minute.
- Odată ce semnalul atinge o linie de bază stabilă (lipozomii sunt gata și coloanele uscate), începeți înregistrarea (figura 3A).
- Adăugați 15 µl dintr-o soluție de 10 mM KCl pentru a calibra sistemul (figura 2A).
- Adăugați lipozomi. Un mic salt ar putea fi vizibil datorită îndepărtării incomplete a proteolipozomilor externi de Cl (figura 3A). Așteptați stabilizarea liniei de bază.
- Se adaugă valinomicină (1 pl la 1 mg/ml în EtOH) pentru a iniția efluxul (figura 3A).
- Lăsați efluxul să-și urmeze evoluția în timp până la platou (figura 3A).
- Adăugați 40 pl de β-octilglucozidă 1,5 M (β-OG) preparată în tamponul extern pentru a dizolva toți lipozomii (figura 3A). Înregistrare completă.
7. O analiză a datelor
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
1/3 conține lipozomi 0 proteine active. Din aceste valori calculăm că rata de transport unitară este γ
2500 Cl - sec -1, în acord cu valorile publicate 8.14.
