Universitatea din Sherbrooke

Universitatea de Sherbrooke Reglementarea receptorului P2X7 de către glucoză și efectorii săi C/EBPa și celulele epiteliale intestinale de către Maude Bilodeau Programul de biologie celulară Disertație prezentată la Facultatea de Medicină și Științe ale Sănătății în vederea obținerii gradului de Master of Science (M .Sc.) În biologie celulară Sherbrooke, Quebec, Canada * 26 noiembrie 2012 Membrii juriului de evaluare Prof. Femand-Pierre Gendron, Departamentul de Anatomie și Biologie Celulară Prof. Claude Asselin, Departamentul de Anatomie și biologie celulară Prof. Alfredo Menendez, Departamentul de microbiologie Maude Bilodeau, 2013

receptorului P2X7

T a b le a te r s CUPRINS. IV LISTA CIFRELOR. VII LISTA TABELELOR. IX LISTA ABREVIERILOR. X INTRODUCERE. 2 1. L in t e s t in. 2 1.1 F o n c t io n e st r u c t u r e g e n e r a l e. 2 1.2 L a x c r y p t e v il l o s ity. 4 1.3 A b so r p t io n e t r é g u l a t io n by g l u c o s e. 7 2. ADENOZINA EXTRACELULARĂ 5 TRIFOSFAT. 11 3. El re cept eu rspur in erg ic P 2 se ns ib les à L A T P. 13 3.1 Le re cept eu r P 2 X 7. 16 3.2 F unct io ns of the P receptor 2 X 7. 18 4.0 L atranscr ip t io n. 19 4.1 Pr o c e s on a r e g u l a t io n. 19 5.0 Fac c t e rurile lui C/E B P. 2 0 5.1 C/E B P a. 2 0 5.1.1 Iso fo r m e s e t l o c a l is a t io n. 2 0 5.1.2 F o n c t io n. 21 5.1.3 M o d e d e g u l a t io n d o t e n t ie l t r a n s c r ip t io n n e l. 21 5.2 C/E B P p. 2 2 5.2.1 Iso fo r m e s and l o c a l is a t io n. 22 5.2.2 Fun c t io n s. 22 5.2.3 M o d e d e g u l a t io n d o t e n t ie l t r a n s c r ip t io n n e l. 23 HIPOTEZE. 25 MATERIALE ȘI METODE. 26 1. M o d è l e s c e l l u l a ir e s. 26 1.1 C a c o - 2. 26 1.2 H E K 2 9 3 T. 26 1.3 IE C -6. 27 2. M o d è l e o u r is. 27 2.1 S o u r is C/E B P p in v a l idé e. 27 2.2 S o u r este NOD. 27

VI 4. Efectul lui g l u c o se u r th e x p r e s s io n d e f a c t e u r s C/EBPa e t p d a n s th e IEC-6 CELLS. 50 5. Efectul lui g l u c o s pe e x p r e s s io n o de C/EBPa e f a c t e u r s în CACO-2 CELLS. 52 6. Rolul C/EBPa ET P s u r l a t r a n s a c iw a t io n o f P2X7 p r o m o t e rs. 54 7. C a pa c ititatea C/EBPp a c t r a c t io n f a c t io n a u r p r o m o t în P2X7 ÎN CELULE CACO-2 STIMULATE CU GLUCOZĂ. 56 8. Efectul C/EBPa și LIP iso f o r m e pr e se n c e on C/EBPP a c t iv a t io n DE LA PROMOTORUL P2X7. 59 9. D e r m in a t io n o d e c a p a c it e o f r e c e p t e u r P2X7 într-un MODEL DE CELULĂ INVALIDAT PENTRU FACTORUL DE TRANSCRIPȚIE C/EBPP. 62 10. Im pactofin val id a t io nof C/EBPp express io n in the ssour is surl ex pr e ssio n OF P2X7, GLUT2 AND C/EB Pa. 64 11. Im pa ctdud ia b è tesurl 'express io ndufacteurdetran sc r ip t io n C/EBPp, RECEPTOR P2X7 ȘI TRANSPORTER GLUT2 ÎN MODELUL NOD MOUSE. Defecțiune! Steag nedefinit i. DISCUŢIE. 73 MULȚUMIRI. 83 REFERINȚE. 84

Tabelul 1: Grunduri utilizate pentru analizele Q-PCR. 29 Tabelul 2: Lista anticorpilor primari utilizați pentru imunobloti. 31 Tabelul 3: Lista anticorpilor secundari utilizați pentru imunobloti. 32 Tabelul 4: Grunduri utilizate pentru amplificarea PCR a promotorului P2X7R uman. 33 Tabelul 5: Grunduri utilizate pentru amplificarea PCR a promotorului P2X7R uman trunchiat. 36 Tabelul 6: Construcțiile promotorului P2X7. 39

L is tedesabr é v ia t io ns AC ADP DNA AMP c ARNA ATP BzATP C/EBP ChIP CREB DAG ERK G-CSF GLUT IL IP3 LAP LIP MAPK NOD NF-kB oatp P300/CBP PKA PKB PKC PI3K PLC adenilat ciclază adenozin dipospat diposfat extracelular acid dezoxiribonucleic AMP ciclic acid ribonucleic adenozină 5 trifosfat 2,3 -o- (benzoil-4-benzoil) -atp CCAAT/proteine ​​care leagă amplificator cromatină imunoprecipitare tabăra-răspuns proteină care leagă elemente diacilglicerol factor stimulator transportoare de glucoză interleukină inozitol 1,4,5-trifosfat Proteină activatoare hepatică Proteină inhibitoare hepatică Protein kinază activată cu mitogen Factor nuclear diabetic non obez-kappa B adenozină 5-trifosfat periodat oxidat p300/proteină de legare CREB protein kinază A proteină kinază B proteină kinază C fosfoinozidă-3-kinază fosfolipază C

XI Q-PCR polimerază cantitativă reacție în lanț Rb retinoblastom Ser serină SGLT1 transport sodiu-glucoză 1 STAT Semnalizatori și activatori ai transcripției T IR tas te receptor tip 1 TB P TATA cutie de legare proteină Thr treonină TNF factor de necroză tumorală WT tip sălbatic

3 SISTEMUL DIGESTIV Vezica biliară Q. Esofag Ficatul Duoden Colon ascendent Intestin Stomac Pancreas Colon transvers Colon descendent Sigmolde Rectum Figura 1: Sistemul digestiv. Sistemul digestiv include mai multe organe prezentate în această diagramă și anume gura, esofagul, stomacul, ficatul, pancreasul, intestinul subțire, colonul și anusul (modificat de la http://www.maalox.fr.). y * '.; -v. Anus

5 membrana apicală, glicocalixul. Acest strat protector este format dintr-un ansamblu de zaharuri prezente în proteinele de membrană. Glycocalyx protejează împotriva enzimelor și substanțelor chimice găsite în lumenul intestinului (Becker și colab., 2010). Pe de altă parte, după cum putem vedea în Figura 2, există mai multe alte tipuri de celule specializate responsabile de diferite funcții importante pentru integritatea organelor (Alberts și colab., 2008). Pe lângă enterocite, găsim celule calice în vilozitate. Aceste celule sunt responsabile pentru secretia mucusului care ține flora intestinală departe de epiteliu și lubrifiază conținutul intestinal pentru a facilita mișcarea alimentelor (Cheng, 1974). Există, de asemenea, celulele enteroendocrine care formează un organ endocrin foarte mare. Acestea sunt responsabile, în parte, de buna funcționare a intestinului și de comunicarea cu alte organe, inclusiv pancreasul și ficatul (Roth și Gordon, 1990). Există 20 de tipuri de celule enteroendocrine care sunt specializate în secreția diferiților hormoni. De exemplu, celulele de tip S secretează predominant secretină (Bloom și Fawcett, 1986).

6 Anjflbinoaafr pnumctcn <> (Scw # De "Cors *" 9 "E nwoendocnne Gobtet m" tuft Enterocyte M-Cells * AWI1 Figura 2: Model de diferențiere a diferitelor tipuri de celule intestinale. Diagrama din stânga reprezintă axa criptă-vilus precum și că diferitele tipuri de celule și diagrama din dreapta reprezintă diferitele semnale care reglementează diferențierea tipurilor de celule prezente în intestin (Gerbe și colab., 2011).

9 ÎNAINTE DE O MĂNĂCĂ LUMINĂ LUMINĂ MINIMĂ SCĂZUTĂ Concentrație scăzută de zahăr SÂNGER ușor Concentrație mare de zahăr o sânge 2 N a \, 2N are puțin, glucoză 5 mm glucoză mult glucoză citiți în continuare Figura 3: Mecanism stabilit pentru absorbția glucozei intestinale înainte și după masă. (A) Înainte de masă, toată glucoza este capturată de transportorul SGLT1 la membrana apicală a enterocitelor. Transportorul Glut2 este localizat la nivel basolateral și permite transportul glucozei din sânge către enterocite pentru a-și menține rezerva de energie. (B) După masă, Glut2 se introduce rapid în membrana apicală a enterocitelor din veziculele intracelulare și devine componenta majoră a absorbției zaharurilor. La nivel basolateral, Glut2 permite ieșirea glucozei și fructozei în sânge. (Modificat din Kellett și Brot-Laroche, 2005).