Utilizarea sinergică a celulelor precursoare neuronale și a peptidelor auto-asamblate în colul uterin experimental

Abstract

Introducere

Mai mult de 50% din leziunile măduvei spinării la nivelul coloanei cervicale. În clinică sunt descrise două mecanisme fiziopatologice principale: contuzia inițială a măduvei spinării și ulterior fracturile osoase de compresie în curs, sângerarea sau umflarea țesutului cauzată.

Modelul de prindere/compresie a clemei anevrismului imită ambele mecanisme fiziopatologice: prinderea clemei creează o prindere, iar durata tăierii asigură componenta de compresie pe care compresia din mediul clinic cauzată de fracturi osoase, sângerări sau umflături ale țesuturilor durează semnificativ mai mult. Clema de anevrism utilizată este schimbată de un arc inelar care garantează forța de tăiere exactă și reproductibilă. În special în comparație cu modelul de semitransecție sau contuzie, acest model de clip de anevrism imită cele mai bune medii clinice. În timp ce pacienții cu leziuni toracice suferă de paraplegie, majoritatea pacienților cu leziuni cervicale sunt tetraplegici și total dependenți. Cu toate acestea, structura anatomică a medularei cervicale diferă semnificativ în comparație cu cea a coloanei vertebrale toracice sau lombare și, prin urmare, este deosebită a protocolului.

Dezvoltarea cavităților medulare și a cicatricilor țesuturilor sunt bariere în calea restaurării și regenerării. Pentru a depăși aceste obstacole, utilizarea materialului de schelă este o abordare promițătoare. Peptidele auto-asamblabile pot fi injectate direct în epicentrul leziunii. Acolo, acestea sunt asamblate în schele din nanofibre, punând capăt cavității și îmbunătățind mediul inhibitor prin reducerea inflamației și a înfricoșării țesuturilor. În timp ce materialele rigide cauzează leziuni semnificative ale măduvei spinării în timpul implantării, peptidele fluide pot fi injectate în condiții de siguranță și fără deteriorări suplimentare grave.

Îmbunătățirea mediului inhibitor cu peptide auto-organizate înainte de transplantul de celule stem susține, prin urmare, integrarea celulară, diferențierea și în cele din urmă recuperarea funcțională după o leziune a coloanei vertebrale cervicale.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

NOTĂ: Următorul protocol experimental a fost aprobat de Comitetul de îngrijire a animalelor din Rețeaua de sănătate a universității (Toronto, Canada) și este stabilit în conformitate cu liniile directoare din Instrucțiunile pentru îngrijirea și utilizarea animalelor experimentale pregătite de Consiliul canadian de îngrijire a animalelor. .

1. Model de contuzie/compresie a clipului de anevrism cervical

2. Injecția de SAP și NPC-uri (14 zile după vătămare)

90% celule vii în suspensia celulară. Diluați celulele în mediu de creștere (50 x 103 celule vii/ul) și utilizați-le pentru transplantul de celule.

  • Faceți patru injecții intraspinale de 2 μl (8 μl volum total, cu 4 x 105 NPC-uri) bilateral la 2 mm rostral și caudal la locul leziunii. După deschiderea durei, așezați micro capilarul Hamilton din sticlă la 1,5 mm sub suprafața dorsală a măduvei spinării și injectați 2 μl din suspensia celulară. Alegeți o rată de injecție de aproximativ 0,5 ml/min (min).
  • La sfârșitul fiecărei injecții și înainte de a scoate capilarul din cablu, așteptați cel puțin 1 min pentru a permite țesutului să se întindă pentru a se potrivi noul volum al celulei. (Figura 2)

    • 3. Implantarea pompelor subdurale pentru aplicarea factorului de creștere

    1. Sacrificați animalele la sfârșitul perioadei de observație (de exemplu, 4 săptămâni după SCI) sub anestezie profundă (5% izofluran timp de 2-3 minute) și spălați-le transcardic cu 50 ml soluție salină rece (4 ° C), urmată de 150 ml rece 4% Paraformaldehidă în soluție salină tamponată cu fosfat 0,1 M (PBS).
    2. Îndepărtați măduva spinării și înmuiați-o în paraformaldehidă 4% în soluție salină tamponată cu fosfat 0,1 M (PBS) timp de 24 de ore.
    3. Puneți măduva spinării într-o soluție de zaharoză 25% pentru crioconservare timp de 48 de ore.
    4. Furnizați criosecțiuni longitudinale cu o grosime de abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Rezultate reprezentative

    În efectuarea procedurii de mai sus, o schelă SAP acoperă cavitatea și oferă o îmbunătățire a mediului inhibitor, mai puține cicatrici ale țesuturilor și o creștere a supraviețuirii NPC., Fig. 4 prezintă o secțiune longitudinală a măduvei spinării de șobolan la locul leziunii obținută la 6 săptămâni după SCI și la 4 săptămâni după injectarea QL6 SAP și transplantul de NPC. Peptidele QL6 au fost injectate cu succes în măduvă, agregate în epicentru și difuze rostro-caudal în penumbra. Imagistica microscopului electronic se arată în continuare Figura 5, unde dispunerea peptidelor QL6 de 1% (greutate/volum) pe o schelă nanofibră este diluată în soluții de PBS în decurs de 2 ore.

    Această matrice oferă o îmbunătățire a mediului inhibitor cu creșterea supraviețuirii și diferențierii celulare, mai puține cicatrici ale țesuturilor și, în cele din urmă, duce la o oportunitate mai bună pentru restaurarea funcțională.

    ure 1 "src ="/files/ftp_upload/52.105/52105fig1highres.jpg "/>Figura 1: Model de anevrism de contuzie/compresie clip (A) Foto prin microscopul chirurgical după laminectomia C7/T1 și contuzia/compresia prin clemă a măduvei spinării de șobolan (B) Garantează imaginea clemei cu arcul inelar precis. Forța de închidere.

    sinergică
    Figura 2: Puncte de injecție ale SAP-urilor și celulelor stem Reprezentarea grafică a Puncte de injecție:. 2 injecții SAP ghidate stereotactic în epicentrul leziunii, urmate de 4 injecții de NPC-uri în coloanele dorsale adiacente la o distanță de 2 mm caudal și rostral de epicentru.

    celulelor

    3: Cateter subdural pentru administrarea factorului de creștere Fotografie cu microscopul chirurgical: (A) S-au implantat catetere subdurale pentru a produce factori de creștere. cateterul este atașat de mai multe suturi 6,0 atunci când mușchii paraspinali sunt atașați; deschidere mică a durei la C5; Poziționarea subdurală a cateterului cu capătul deschis al cateterului lângă leziune la C7/T1. (B) Cateter conectat la o micropompă într-o adâncitură subdurală atașată la flancul lateral.

    celulelor
    Figura 4: Livrarea cu succes a SAP-urilor și NPC-urilor către măduva cervicală Colorare fluorescentă (fundal DAPI, albastru) pentru o secțiune longitudinală a măduvei spinării traumatizate şobolan. SAP-urile marcate (QL6-FITC, verde) s-au agregat în epicentrul leziunii. NPC-urile injectate (DsRed pozitiv, roșu) sunt în direcții rustale și caudale difuze. Bara de măsurare indică 5 mm.

    celulelor
    Fig. 5: Formarea cadrului nanofibrelor Imaginea microscopului electronic cu scanare (SEM) arată schela nanofibră a SAP-urilor montate. Bara de scalare se referă la 1 um).

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Discuţie

    Acest protocol a fost conceput pentru a permite cititorului să efectueze un model de leziune a gâtului la șobolani și să utilizeze o abordare combinată de tratament cu SAP-uri și NPC-uri, promovând o mai bună recuperare după SCI la nivelul gâtului.

    Mai ales în comparație cu alte modele de leziuni ale coloanei cervicale, cum ar fi modelul (hemi) -transecție sau modelele de pierdere în greutate și comotie, modelul de contuzie/compresie prin clip reprezintă cele două mecanisme principale fiziopatologice ale traumei - vânătăi și presiune - și, prin urmare, imită cel mai bine Condiții. Deși a fost creat recent pentru a fi utilizat la șobolan și la șoarecele BWS 7-11, este potrivit pentru utilizare în coloana cervicală. Acesta a fost un pas important, deoarece leziunile măduvei spinării cervicale sunt cele mai frecvente observate în clinică, iar anatomia cervicală este foarte diferită de cea a coloanei vertebrale toracice. În plus, pacienții cu SCI la nivelul gâtului cu tetrapareză se străduiesc să restabilească cel puțin parțial ungerea motorie a extremităților superioare.

    Peptidele auto-asamblate au fost identificate cu potențialul de a acoperi cavitatea și, de asemenea, de a îmbunătăți mediul inhibitor la locul leziunii, ducând în cele din urmă chiar la regenerarea axonilor și germinarea 5, 12,13,14. Nanofibrele QL-6 se asamblează pentru a crea schele care pun în punte cavitatea medulară și astfel pot oferi o matrice pentru încolțirea și regenerarea axonală și îmbunătățirea mediului inhibitor înainte de transplantul de celule. Avantajele acestor peptide constau în vâscozitatea lor scăzută (fluid) și pH-ul neutru. În special în comparație cu hidrogelurile foarte vâscoase sau schelele tisulare, SAP-urile pot fi ușor injectate în măduva spinării rănită și leziunile ulterioare derivate din injecția în sine sunt limitate.

    Deși nanofibrele QL6 pot îmbunătăți supraviețuirea celulelor 4,15, totuși utilizarea factorilor de creștere pare a fi benefică pentru 16,17,18,19,20,21. Ele pot fi administrate fie prin intermediul factorilor de creștere fără hidrogel 22, fie prin aplicare prin pompe osmotice (așa cum este descris mai sus). Pompele osmotice conectate la catetere subdurale au avantajul unei eliberări continue și controlate și, prin urmare, o îmbogățire a lichidului măduvei spinării cervicale (LCR). Aranjarea cateterului subdural este totuși dificilă, în special în ceea ce privește cicatricile mari care au apărut la câteva săptămâni după leziune.

    Pentru a crea condiții tisulare bune pentru supraviețuirea și integrarea NPC, mai multe studii au selectat puncte de injecție în substanța albă vecină, de 2 mm rostral sau caudal la leziune și nu direct în epicentrul leziunii 4,15,18. Acolo, NPC-urile au șanse mai mari de supraviețuire, integrare și diferențiere în astrocite, oligodendrocite și neuroni și pot migra către sau în leziune, rezultând înmugurirea axonală și o conectivitate axonală îmbunătățită.

    După însușirea acestor tehnici, acest protocol propus ar putea fi acceptat de către utilizatorul individual în funcție de nevoile și interesele acestora, modificări ale nivelului și gravității vătămării, utilizării diferitelor tipuri de celule sau factori de creștere sau împreună cu alte substanțe neuro-protectoare .

    În golurile și cicatricile țesuturilor: pe scurt, tratamentul combinat cu SAP și NPC-uri poate oferi o abordare nouă și promițătoare pentru a depăși cele mai dificile obstacole în tratamentul SCI.

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Mulțumiri

    Am dori să recunoaștem sprijinul finanțat pentru această lucrare de la Institutele Canadiene de Cercetare în Sănătate (CIHR), Fundația Familiei Krembil, Catedra Halbert în Reparații și Regenerare Neurală, Phillip și Peggy DeZwirek și Gordon Yao pentru contribuții la 2 Klaus Zweckberger a fost susținut de un grant de la „Deutsche Forschungsgesellschaft” (DFG).