A 56-a Nefrectomie în combinație cu o dietă bogată în sare și inhibarea sintazei oxidului nitric de inducere

rezumat

Este descrisă o procedură în doi pași pentru stabilirea insuficienței renale cronice (CRF) la șobolanul Lewis prin îndepărtarea chirurgicală a 5/6 din masa renală. Combinația intervenției chirurgicale, inhibarea NOS și o dietă bogată în sare duce la un model similar cu CKD uman, permițând studiul mecanismelor cauzale și dezvoltarea unor noi intervenții terapeutice.

Abstract

Introducere

Datorită naturii sale progresive, a bolii renale ulterioare, și a morbidității și mortalității cardiovasculare asociate, ERC este o problemă de sănătate publică în creștere. Prin urmare, încetinirea progresiei CKD este o mare prioritate pentru sănătate. Deoarece CKD se caracterizează prin tulburări complexe ale homeostaziei, sunt necesare modele animale integrate pentru a studia dezvoltarea și progresia CKD. Rinichiul este alcătuit dintr-o multitudine de diferite tipuri de celule care interacționează între ele. Această complexitate nu poate fi mimată in vitro.

Protocol

Toate experimentele sunt efectuate în conformitate cu orientările etice experimentale pe animale ale Comitetului pentru animale de laborator din Utrecht. Protocolul se desfășoară sub îndrumarea și aprobarea Comitetului de îngrijire și utilizare a animalelor instituției autorului.

CKD este indusă la șobolanii masculi consangvin Lewis (Charles River, Sulzfeld, Germania) la vârsta de 8 săptămâni. Șobolanii sunt adăpostiți în condiții standard într-un mediu controlat de lumină, temperatură și umiditate.

  1. Sterilizați instrumentele chirurgicale:
    • 1 pensă elev 1-2 dinți 12 cm
    • 1 clește cu model standard pentru elevi
    • 2 clești Semken
    • 1 foarfeca Mayo
    • 1 foarfeca Iris student
    • 1 suport pentru ace Olsen-Hegar cu foarfece
    • Pătură
  2. Verificați lista de inventare:
    • Masă de operație cu tampon de încălzire și lampă
    • O 2, izofluran
    • țesut
    • Aparat de ras
    • Cântare
    • Punct de referință steril de funcționare
    • Tifon steril 5x5 și 10x10
    • 70% alcool
    • Soluție de NaCI 0,9%
    • Seringă de 1 ml
    • Ace (25G)
    • Plăcuțe de spumă cu gel: Spongostan
    • Vicryl 4.0 și 5.0
    • Buprenorfină 0,03 mg/kg (diluat 1:10 în soluție salină fiziologică)
    • Cusca curata pentru sobolani dupa operatie

2. Uninefrectomia din partea dreaptă

3. Nefectomia subtotală în partea stângă

  1. Șapte zile mai târziu, se fac aceleași pregătiri în partea stângă pentru partea dreaptă, așa cum este descris la 2.1-2.5. Înainte de operație, se calculează cantitatea de țesut renal care trebuie îndepărtat, care este de aproximativ 2/treimi din greutatea rinichiului drept. Pregătiți bucăți mici de spumă de gel (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey) înainte de operație.
  2. Așezați foarfece ascuțite în jurul polului superior al rinichiului stâng și rezecția polului superior într-o singură lovitură (pentru localizarea foarfecelor, consultați Figura 3). Acoperiți imediat cu o bucată de spumă de gel și aplicați o presiune ușoară cu tifon steril.
  3. Repetați cu polul inferior al rinichiului ca la 3.3.
  4. Ridicați rinichii pentru a preveni coagularea pielii. Mențineți o presiune ușoară pe ambele plăcuțe de spumă cu gel cu tifon steril până când sângerarea se oprește. Dacă sângerarea continuă, adăugați un alt covor de spumă.
  5. Așezați rinichiul rămas cu tampoane de spumă gel adezivă în abdomen. Închideți mușchii și pielea și urmați 2.9-2.12.

  1. Supravegherea Sham a suferit aceeași procedură pentru a expune rinichii. În loc să eradicați rinichiul sau să tăiați tijele o săptămână mai târziu, ambii rinichi sunt decapsulați la un interval de o săptămână, nefiind deranjați să deranjeze glandele suprarenale. Închiderea plăgii și îngrijirea postoperatorie sunt identice până la 2.11 și 2.12.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

După nefrectomia subtotală este aproximativ 1: 6 din masa renală totală rămasă. Figura 4 arată greutatea părții îndepărtate a rinichiului drept cu deviație medie și standard în două experimente anterioare. Trebuie avut în vedere faptul că în săptămâna de după UNX apare hipertrofia rinichiului stâng, ceea ce indică faptul că greutatea care trebuie calculată pe baza greutății rinichiului drept are ca rezultat întotdeauna mai puțin de 5/6 distanță. Cu toate acestea, deoarece nu este posibil să se determine greutatea rinichiului stâng în timpul intervenției chirurgicale, acesta este modul exact de a elimina aproximativ 5/6 din masa inițială a rinichilor.

În timp, șobolanii cu BCR dezvoltă hipertensiune, uremie, anemie, proteinurie și scăderi semnificative ale GFR și ERPF. După 6 săptămâni, CKD a devenit stabilit, un moment adecvat pentru testarea măsurilor de salvare. În timp, se observă o progresie accentuată a hipertensiunii și proteinuriei, în timp ce hematocritul și funcția renală (GFR și ERPF) prezintă deteriorări ușoare (Figura 5). Alte simptome pe care nu ne-am concentrat în experimentele noastre sunt tulburările de fosfat de calciu și metabolismul lipidelor și multe altele. În funcție de stresul de la șobolani, dezvoltarea CKD poate varia foarte mult 14, 15, 2. Am folosit dieta bogată în sare și un blocant NO pentru a induce tensiunea arterială crescută și disfuncția endotelială.

Progresia insuficienței renale este urmărită prin colectarea de urină (utilizată pentru a măsura cantitatea de proteine ​​și creatinină), sânge (uree și creatinină plasmatică) și tensiunea arterială sistolică. Suntem conștienți de faptul că dezvoltarea tensiunii arteriale ridicate poate fi urmărită mai exact atunci când se utilizează telemetria în loc de pletismografia manșetei cozii. Clearance-ul creatininei poate fi calculat, dar tinde să subestimeze scăderea GFR datorită secreției tubulare extinse de creatinină la șobolani 16, subliniind importanța metodei standard de aur pentru determinarea funcției renale prin determinarea clearance-ului inulinei și PAH 17, 18, 19 . Koeners și colab. a descris întreaga procedură 20. Clearance-ul inulinei și PAH este calculat din concentrația lor în proba de urină (U), debitul de urină (V) și concentrația plasmatică (P). Am demonstrat anterior o reducere semnificativă a GFR și ERPF în acest model folosind tehnologia clasică de eliminare, în timp ce acest lucru a fost mai puțin evident din modificările creatininei plasmatice, ureei plasmatice sau clearance-ului creatininei 13.

dietă
Figura 1. Linia de timp a L-NNA, dietă bogată în sare, UNX și SNX. Sunt date măsurători longitudinale ale funcției renale și timpul de terminare pentru determinare. Cu o urmărire mai lungă după necesitățile SNX, nutriția cu 6% NaCl poate fi continuată în timp.

98fig2.jpg "/>Figura 2. Disecția glandei suprarenale. Pentru a îndepărta glanda suprarenală fără a o deranja, puneți forcepsul în grăsimea dintre rinichi și glanda suprarenală și deplasați-vă de la polul vasului până la vârf, așa cum este indicat de linia roșie. Ilustrație adaptată din cea de-a 20-a ediție din SUA a Anatomy of the Horror of the Human Body, 1918.

nefrectomie
Figura 3. Nefectomie subtotală. Liniile roșii prezintă muchii tăietoare. Ilustrație adaptată din cea de-a 20-a ediție din SUA a Anatomy of the Horror of the Human Body, 1918.

56-a
Figura 4. Porțiunea a eliminat țesutul renal după nefrectomia subtotală în două experimente diferite. Exp 1, n = 16, exp 2, n = 23.

dietă
Figura 5. Dezvoltarea insuficienței renale la șobolanii CKD s-a încheiat la 6 săptămâni după SNX (linii discontinue n = 5) față de controalele sănătoase (linii sub formă de linii n = 5) și șobolanii CKD s-au încheiat la 12 săptămâni după SNX (£ n = 8) față de controalele sănătoase (• n = 8 ). Șobolanii CKD au primit L-NNA până în săptămâna 4 și o dietă bogată în sare din săptămâna 1 până la terminare (nu este prezentat în grafic). SNX induce hipertensiune (măsurată prin pletismografie a cătușei) (A), Uremie (B), anemie (C) și proteinurie (D) și reducere semnificativă a GFR (E) și ERPF (F) 13. * Abonamentul p specificat este necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Îndepărtarea chirurgicală a 5/6 din masa renală la șobolanul Lewis, combinată cu o dietă bogată în sare și inhibarea temporară a NOS conduce la un model de BCR care seamănă cu BCR umană și permite investigarea mecanismelor cauzale și a eficacității intervențiilor terapeutice în CKD.

Modelul 5/6 de nefrectomie este un model bine cunoscut și descris pe scară largă pentru BCR. Cu toate acestea, eliminarea simplă a 5/6 din masa renală nu provoacă imediat insuficiență renală la toate tulpinile de șobolan. Folosim șobolani Lewis pentru a studia efectele terapiilor pe bază de celule în CKD, deoarece disponibilitatea șobolanilor GFP + Lewis poate 21 de celule de urmărire a celulelor donatoare administrate la șobolanul primitor (nonGFP +). Șobolanul Lewis este relativ rezistent la dezvoltarea insuficienței renale, iar dezvoltarea CKD este lentă în comparație cu alte tulpini 22, 15. Prin urmare, îndepărtarea a 5/6 din masa renală este combinată cu epuizarea NO și o dietă bogată în sare, deoarece aceasta seamănă cu mai multe aspecte ale CKD umană, cum ar fi aportul ridicat de sare și disfuncția endotelială. Cititorii trebuie să țină cont de faptul că necesitatea combinării nefrectomiei 5/6 cu o dietă bogată în sare și/sau lipsă de oboseală depinde de tulpina șobolanilor utilizată pentru experimente.

Am efectuat nefrectomia 5/6 într-o procedură în două etape, mai degrabă decât într-o singură etapă, întrucât aceasta este privită ca fiind mai puțin stresantă la animal, este asociată cu o mortalitate chirurgicală mai mică și este preferată de comitetul nostru de testare pe animale. Am preferat incizia flancului mai degrabă decât laparatomia pentru a ajunge la rinichi, deoarece laparotomia este asociată cu un risc mai mare de infecții ale plăgilor, slăbirea cusăturilor, hernierea discului subcutanat și aderențele intestinului peste incizia flancului. Mai mult, dacă proiectarea experimentală implică o intervenție cu incizie abdominală - așa cum este cazul în studiile noastre experimentale privind administrarea celulelor măduvei osoase în artera renală a restului de rinichi laparotomii care efectuează rinichi pentru SNX nu este recomandat deoarece laparotomiile repetate ar trebui evitate.

Mai multe probleme critice pot apărea după îndepărtarea chirurgicală a 5/6 din masa renală. În timpul UNX poate exista dificultăți în stabilizarea rinichiului, deoarece grăsimea din jur va fi slăbită cu ușurință. Două metode pot fi utilizate pentru ca rinichii să fie expuși. 1) Folosiți o pensetă mai mică pentru a apuca vasele renale deplasându-vă ușor în jos de la polul inferior al rinichiului spre vasculatură și trăgând ușor până când puteți stabiliza rinichiul. 2) Folosiți forceps contondent pentru a îndepărta ușor rinichiul din abdomen. Când rinichiul este expus, tifonul poate fi folosit pentru a opri sângerările care apar în timpul acestui proces. Pentru a evita sângerarea, grăsimea începe să tragă de polul inferior al rinichiului, unde grăsimea este puternic atașată de rinichi.

Este important să creați între nodul din jurul vasului renal și rinichi pentru a preveni sângerarea după îndepărtarea rinichiului, deoarece nodul va aluneca de pe vasele renale datorită fluxului sanguin de intrare, umplând rapid abdomenul cu sânge. Se poate folosi un tifon pentru îndepărtarea sângelui și se poate aplica presiune pentru a opri sângerarea. Utilizați forceps pentru a apuca renal și a crea o nouă ligatură. Dacă vasele renale nu pot fi urmărite, mențineți presiunea până când sângerarea se oprește. 1 ml de soluție salină fiziologică pentru a preveni deshidratarea din cauza sângerărilor din cavitatea abdominală și așteptați aproximativ 5 minute înainte de a închide stratul muscular și al pielii. Monitorizați suplimentar șobolanul cu atenție pentru următoarele zile. Dacă bandajul există înainte de îndepărtarea rinichiului, dar vasele renale rulează, capetele lungi ale ligaturii pot fi utilizate pentru a lega vasele.

Dacă după disecția stâlpului, în ciuda menținerii presiunii pe tampoanele cu gel de spumă, dacă există sângerări, acest lucru se datorează probabil leziunii unei artere renale mari sau a bazinului renal. Această sângerare poate fi oprită prin plasarea de noi plăcuțe de spumă de gel pe rană, fără a vă deranja să mutați plăcuța de spumă în timp ce ridicați rămășița, deoarece vasele mai mari sunt lângă ombilic și așteptând o perioadă mai lungă de timp.

Sângele în urină poate reveni până la 2 zile după operație. Dacă pelvisul renal este deteriorat sau există o sângerare funcțională renală mare, va exista o urmă de hematurie persistentă. Șobolanii cu hematurie persistentă după intervenția chirurgicală trebuie eutanasiați, deoarece nu este posibilă oprirea sângerării. Dacă hematuria este observată la un moment ulterior după operație, care poate apărea până la 2 săptămâni după operație, șobolanul ar trebui, de asemenea, să fie eutanasiat, deoarece sângele s-a coagulat în pelvisul renal și, în cele din urmă, înfundă ureterele și vezica urinară, provocând obstrucție.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.