Colecția Breath de la Protocolul de descoperire a biomarkerilor pentru copii pentru boli (tradus în germană)
rezumat
Acest protocol descrie o metodă simplă pentru obținerea probelor de respirație de la copii. Pe scurt, eșantioanele de aer amestecat sunt preconcentrate în tuburi de sorbent înainte de analiza cromatografiei de gaze-spectrometrie de masă. Biomarcatorii respiratori ai bolilor infecțioase și neinfecțioase pot fi identificați folosind această metodă de colectare a respirației.
Abstract
Introducere
Biomarkerii pot transporta informații valoroase despre procesele biologice normale și patologice care pot contribui la boala identificabilă clinic. Recent, a crescut interesul pentru evaluarea volatilelor respiratorii ca biomarker pentru o varietate de stări de boală, inclusiv infecții, tulburări metabolice și cancer 1. Aerul expirat conține cantități cuantificabile de compuși organici volatili (VOC), compuși organici semi-volatili și material derivat microbial (de exemplu, acizi nucleici de la bacterii și viruși). Scopul central al analizei aerului expirat este o perspectivă neinvazivă asupra stării unei boli și/sau a influențelor mediului. Există mai multe metode de colectare și analiză a aerului expirat, în funcție de elementele constitutive de interes. În prezent, nu există nicio metodă standardizată de inspecție a aerului expirat care să facă mai dificilă analiza comparativă a rezultatelor din studii. Standardizarea procedurii de colectare a respirației este importantă, deoarece procedura de eșantionare în sine are un impact semnificativ asupra rezultatelor din aval ale respirației.
În multe studii, eșantionarea tardivă a respirației căilor respiratorii este utilizată 2, 3. Această selecție include aruncarea primei părți a aerului expirat („spațiul mort”) pentru a capta preferențial aerul la sfârșitul ciclului de respirație. Avantajul acestei strategii este că reduce la minimum nivelul COV exogeni (de exemplu COV ecologici), îmbogățind în același timp pentru COV endogeni, specifici pacienților. Această metodă împiedică individul să expire în primele câteva secunde înainte de a colecta proba de respirație. Alți cercetători au folosit un senzor de presiune pentru a activa eșantionarea într-o secvență de fază predefinită 4, 5. Deoarece senzorii de presiune necesită o tehnologie complexă, această metodă alternativă necesită echipamente dedicate și relativ costisitoare de prelevare a probelor.
Prelevarea probelor respiratorii la copii poate fi deosebit de dificilă. O preocupare majoră este că copiii mici nu ar putea să lucreze cu bușteni pentru expirarea voluntară a aerului „spațiu mort”. Din această cauză, este mai ușor să obțineți respirație mixtă a căilor respiratorii de la copii. Cu toate acestea, o limitare importantă cu probele de respirație mixte ale căilor respiratorii este riscul contaminării mediului și a materialelor. Prin urmare, fezabilitatea colectării pediatrice este o preocupare motrice în domeniu.
În plus față de metodele de colectare a datelor, reținerea probelor de respirație poate afecta și calitatea probei. Umiditatea ridicată în respirație expiră și concentrațiile ultra-scăzute (părți pe bilion) de compuși organici volatili fac probele de respirație respiratorii deosebit de predispuse la probleme legate de memorie 6, 7. În ciuda potențialului mare al tehnicilor în timp real, cum ar fi spectrometria de masă a reacției de transfer de protoni (PTR-MS), GC-MS rămâne standardul de aur pentru analiza probelor de respirație. Deoarece analiza GC-MS a probelor de respirație este o tehnică offline, este cuplată cu metode de preconcentrare, cum ar fi tuburile de desorbție termică (TD), extracția în fază micro-solidă și dispozitivele de captare a acului. Probele de respirație trebuie depozitate temporar în pungi de polimer 8 înainte de preconcentrare. Pungile din polimer sunt populare datorită prețului moderat, durabilității relativ bune și reutilizării. În timp ce pungile pot fi refolosite, este nevoie de timp și efort pentru a asigura o curățare eficientă 7, 8. Fiecare sac specific necesită, de asemenea, proceduri determinate empiric și standardizate pentru controlul calității, reutilizarea și recuperarea.
Tuburile TD sunt utilizate pe scară largă pentru preconcentrarea respirației, deoarece captează un număr mare de substanțe volatile și pot fi personalizate. Materialele absorbante utilizate pentru ambalarea tuburilor TD pot găzdui aplicații specifice și ținte volatile specifice de interes. Tuburile TD îmbunătățesc semnificativ confortul studiilor biomarkerului respirației, în special în pajiștile îndepărtate, deoarece tuburile TD stochează în siguranță volatilele respirației timp de cel puțin două săptămâni și sunt ușor de transportat 3 .
Într-un efort de a standardiza colectarea respirației pediatrice pentru descoperirea biomarkerilor, descriem aici o metodă simplă de colectare a respirațiilor de la copii. Pentru a ilustra rezultatele reprezentative ale protocoalelor implementate, datele anonimizate sunt prezentate unei cohorte în curs de desfășurare a copiilor (8-17 ani) în evaluarea bolii hepatice grase nealcoolice (NAFLD). Rezultatele complete și analiza acestui studiu vor fi raportate într-o publicație ulterioară. Procedând astfel, raportăm un subset de date pentru a demonstra aplicarea protocolului nostru. Pe scurt, copiii sunt instruiți să expire în mod normal prin muștiuc într-o pungă de polimer, ca și când ar „sufla un balon”. Procesul se repetă de 2-4 ori până se colectează 1 L de respirație. Eșantionul este apoi transferat într-un tub TD și depozitat la 5 ° C înainte de analiza GC-MS.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Studiul a fost aprobat de Institutional Review Board al Washington University School of Medicine (# 201709030). Consimțământul a fost obținut de la un părinte sau tutore legal înainte de înscrierea în studiu. Fotografii din Figura 2 reprodus cu acordul scris al părinților.
(3) Transmisia respirației pe tuburile de desorbție termică
- Colectați probele de aer înconjurător în jurul pacientului imediat după respirație.
- Așezați punga la ieșirea pompei cu furtun, ca în figura suplimentară 5afișate.
- Îndoiți tija sacului supapei în jos pentru a deschide ansamblul de admisie pentru prelevare.
- Blocați supapa deschisă rotind șurubul zimțat zimțat pe partea laterală a racordului de admisie în sensul acelor de ceasornic.
- Porniți pompa și rulați la 100 ml/min timp de 12 minute. Pompa va colecta 1200 ml de aer ambiant.
- După ce volumul dorit s-a colectat, slăbiți șurubul zimțat zimțat de pe partea ansamblului de admisie rotindu-l în sens invers acelor de ceasornic și împingeți tija supapei până când racordul de admisie este complet.
- Blocați supapa de buzunar rotind în sensul acelor de ceasornic șurubul degetului zimțat de pe partea laterală a fitingului de intrare închis.
- Deconectați punga de la pompă.
- Aceiași pași ca în secțiunea 3. Singura diferență este că aerul ambiant, compușii organici volatili sunt transferați, nu cei de respirație.
NOTĂ: Condițiile pentru analiza probelor de respirație și aer au fost descrise în 9.
- Analizați datele colectate și identificați compușii din cromatograme. Utilizați programe software tipice pentru a găsi și a face toate conexiunile realizate de instrument (Figura 3A) recunoscut. De exemplu, o funcție de deconvoluție pentru identificarea compușilor. Date de filtrare cu un factor de dimensiune a ferestrei de reținere de 80, filtru de înălțime a masei ≥ 100 conturi și filtru compozit de zonă absolută ≥ 500 conturi.
- Utilizați standarde chimice pentru compușii identitari în probele de respirație și aer. Extrageți zona de vârf a ionului de bază al compușilor de interes, cum ar fi izoprenul și β-pinenul (Figura 4) și comparați nivelurile volatile din respirație și aer.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
În studiul nostru, probele de respirație colectate de la 10 copii (8-17 ani) au fost în prezent evaluate la Spitalul de Copii din St. Louis. Probele de respirație și aer ambiant (n = 10) au fost colectate așa cum s-a descris mai sus. Probele au fost analizate folosind cromatografia gazoasă, spectrometria de masă cu timp de zbor cvadrupolar (GC-QToF-MS) și desorbția termică așa cum este descris mai sus 9. După îndepărtarea contaminanților de fond, protocoalele puse în aplicare au dus la o medie de 311 de compuși organici volatili (COV) în fiecare dintre probele mixte de aer expirat. În medie, s-au găsit semnificativ mai mulți COV în probele de respirație comparativ cu controalele ambientale/de mediu (311 ± 11,5 față de 190 ± 12,6, p Fig. 3A). Numărul crescut de COV în respirație, comparativ cu aerul înconjurător, este caracterizat vizibil prin cromatograme ionice totale reprezentative (TIC) (Fig. 3 b) pentru a compara.
Ca o măsură de control al calității cu succes a colectării respirației, nivelurile a doi COV respirați obișnuiți (izopren și β-pinen) în comparație cu regulatoarele de aer Zimmer (Figura 4). Izoprenul, unul dintre cei mai abundenți COV din respirație, se găsește de obicei în niveluri de părți per miliard (ppb) (131 ppb), în timp ce β-pinenul se găsește în niveluri sub-ppb (0,59 ppb) 6. Ambii compuși sunt stabiliți în respirația adulților sănătoși în comparație cu nivelurile scăzute prezente în aerul interior, indicând că procesele fiziologice normale sunt îmbogățite ca sursă primară pentru acești analiți în respirație 6. La acel moment, izoprenul (m/Z 67) a fost reținut timp de 2,12 minute și β-pinenul (m/Z 93) a fost reținut timp de 14,4 minute. Am descoperit că abundența probelor de respirație pediatrică cu izopren a fost de 10 ori mai mare decât în regulatoarele de aer din cameră (Fig. 4; plenitudinea medie ± SEM sunt 4,2x10 5 ± 1,0x10 5 și 3,9x10 4 ± 0,9x10 4 pentru respirație și aer și p = 0,0003) și β-pinenul a prezentat o plenitudine de 3 ori mai mare în respirație decât aerul (plenitudinea mea ± SEM sunt 3,0x10 4 ± 1,3x10 4 și 9,1x10 3 ± 1,6x10 3 pentru respirație și respectiv aer = p = 0,007), confirmă colectarea cu succes a respirației. Analiza descriptivă completă a descoperirilor Biomarker Discovery din acest studiu va fi raportată într-o publicație viitoare.
Figura suplimentară 1: Prelevare de respirație. Stânga: (A) Eșantionator de respirație: 1) adaptor tată + conector (2) supapă cu bilă cu două căi + 3) adaptor teflon tată. (B) Piesa bucală din carton. (C) furtun cu diametru mic și mare. Dreapta: Prelevator de respirație cu muștiuc și tuburi atașate. Vă rugăm să faceți clic aici pentru a descărca acest fișier.
Figura 2 suplimentară: Diferite volume de respirație. Deasupra sunt imagini ale unui sac de colectare umplut cu cantități variate de aer (1 L, 2 L și 2,5 L), ca reprezentare vizuală a volumelor de respirație aproximative care trebuie colectate. Vă rugăm să faceți clic aici pentru a descărca acest fișier.
Figura suplimentară 3: Supapă pe buzunar. În stânga: tija supapei este în jos (supapa de buzunar este deschisă). Blocați supapa de buzunar rotind în sensul acelor de ceasornic șurubul degetului zimțat de pe partea laterală a fitingului de admisie închis. Geanta este gata să adune respirația. Dreapta: tija supapei este în partea de sus (buzunarul supapei închis). Vă rugăm să faceți clic aici pentru a descărca acest fișier.
Figura suplimentară 4: Transferul respirației. Stânga: Tub absorbant (1) atașat la un capăt al sacului cu tuburi cu diametru mic și mare și la celălalt capăt al pompei. Dreapta: Notați capătul canelat pe tubul absorbant; capătul canelat trebuie să indice spre punga de colectare. Vă rugăm să faceți clic aici pentru a descărca acest fișier.
Figura suplimentară 5: Colectarea aerului ambiant. În stânga: Pompa cu două conexiuni: intrare și ieșire. Deschiderea de evacuare este inclusă cu o geantă de colectare. Deschiderea de admisie va aspira aerul ambiant și îl va transfera în pungă. Dreapta: Sistem de colectare a aerului ambiant configurat. Vă rugăm să faceți clic aici pentru a descărca acest fișier.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
În ciuda progreselor semnificative în cercetarea respirației din ultimul deceniu, procedurile standardizate pentru prelevarea de probe și analiza gazelor volatile ale respirației rămân nedefinite 10. Unul dintre principalele motive pentru această lipsă de standardizare a fost varietatea metodelor de colectare a datelor despre respirație care au un impact direct asupra diversității chimice rezultate în orice probă de aer expirată. Exhalatul de atem conține o gamă largă de compuși organici volatili în concentrații foarte diferite 6. Prin urmare, schimbarea metodelor de anchetă nu numai că modifică abundența, ci și varietatea substanțelor care pot fi prezente într-un eșantion.
Eșantionarea gazelor respiratorii este surprinzător de complexă. În timp ce subiecții trebuie să expire în piesa bucală a unui colector sau într-un recipient etanș la gaze înainte de analiză, eșantionarea respirației trebuie să ia în considerare și să țină cont de o serie de variabile posibile. În această lucrare demonstrăm un protocol specific, validat pentru gazarea respirației la copii. Până în prezent, am implementat cu succes acest protocol cu copii febrili de până la 4 ani, într-un scenariu de teren într-un mediu cu resurse restrânse (Malawi), solare termice în studiul respirației noastre și analiza conductelor pentru descoperirea biomarkerilor 9. Apoi, am implementat și evaluat și protocoalele noastre pentru colectarea probelor de respirație de la copiii supuși evaluării într-o clinică modernă de pediatrie adjuvantă din Statele Unite. Rezultatele noastre sugerează că, pentru identificarea biomarkerilor respiratori pediatrici, colectarea aerului amestecat este esențială, deoarece oferă o „amprentă respiratorie” reală de la un individ dat. În plus, respirația expiratorie mixtă este, de asemenea, cel mai simplu tip de respirație care poate fi realizat deoarece toate fazele aerului expirat (gura și nasul) sunt dobândite 3.
Pe teren, și mai ales atunci când subiecții sunt grav bolnavi, poate fi dificil de controlat pentru confuzii obișnuiți, cum ar fi dieta, temperatura corpului și/sau utilizarea parfumurilor sau cremelor cu un anumit subiect. Acești factori pot avea un efect profund asupra volumului și calității respirației. Din acest motiv, recomandăm anchetatorilor nu numai să înregistreze timpul de captare a respirației și livrarea în tuburile de sorbent, dar iau în considerare și alți factori specifici pacienților, cum ar fi dieta (de exemplu, reamintirea dietei de 24 de ore), utilizarea apei de gură și utilizarea medicamentelor, pentru a evalua în mod specific efectele acestor potențiali confundători în timpul descoperirii biomarkerilor și a analizelor din aval.
Compușii inhalați din aerul înconjurător afectează, de asemenea, compoziția aerului expirat, care poate reprezenta o provocare pentru eforturile de descoperire a biomarkerilor de respirație. Analiza și înregistrarea aerului înconjurător este, prin urmare, un control critic, cedând unor cunoștințe importante despre originea volatilelor de aer expirat. De exemplu, profilurile volatile ale aerului înconjurător au fost utilizate pentru a determina dacă o anumită respirație este volatilă la o plenitudine mai mare sau mai mică a respirației, în comparație cu aerul înconjurător 11. Prin urmare, un anumit compus al respirației este considerat a fi derivat din interiorul corpului (de exemplu, de origine endogenă) dacă concentrația este mai mare în respirație decât în aer, în timp ce o concentrație mai mică în respirație indică faptul că această substanță a fost derivată din mediu (de ex. . origine exogenă). Compararea abundenței volatile în respirație cu aerul interior servește, de asemenea, ca un control pozitiv important pentru a stabili dacă colectarea respirației este adecvată. Ca și în datele noastre reprezentative (Figura 4) a demonstrat că compusul volatil izopren este de origine endogenă și ar trebui să fie prezent în probele de respirație în concentrații> de 10 ori mai mari decât aerul din jur 6 .
Pentru descoperirea biomarkerilor, profilurile volatile ale persoanelor cu condiții de interes trebuie comparate cu un control sănătos corespunzător al indivizilor, astfel încât modelele să poată fi identificate folosind metode statistice, cum ar fi învățarea automată și analiza multivariată. Metoda de colectare a respirației descrisă aici poate fi aplicată la o varietate de condiții patologice; singura cerință este ca copilul să se ofere voluntar cu eșantionarea respirației. Deoarece testarea respirației este neinvazivă, se repetă pur și simplu și este egală cu concentrațiile arteriale ale substanțelor biologice, aceasta are o mare promisiune pentru implementarea testelor la punctul de îngrijire pentru uz clinic.
Lucrările viitoare se vor concentra pe dezvoltarea de noi metode de colectare a respirației la sugarii și copiii mici (abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Dezvăluiri
Autorii nu au dezvăluit nimic.
Mulțumiri
Mulțumim copiilor și familiilor Spitalului de Copii St. Louis care au participat la acest studiu. Recunoaștem eforturile unice ale doamnei Stacy Postma și doamnei Janet Sokolich în timpul colecției Breath. Această lucrare este susținută de Fundația Spitalul de Copii din St. Louis.