Colecția de regiuni ale creierului de rozătoare înghețate pentru protocolul de analiză în aval (tradus în franceză)

rezumat

Această procedură descrie colectarea regiunilor discrete ale creierului înghețate pentru a obține proteine ​​și ARN de înaltă calitate folosind instrumente ieftine și disponibile în mod obișnuit.

Abstract

Pe măsură ce înțelegerea noastră despre neurobiologie a progresat, analizele moleculare sunt adesea efectuate pe zone mici ale creierului, cum ar fi cortexul prefrontal medial (MPFC) sau nucleul accumbens. Provocarea în această lucrare este de a diseca zona corectă, păstrând în același timp micromediul care urmează să fie examinat. În acest articol, descriem o metodă simplă și ieftină, folosind resurse disponibile în majoritatea laboratoarelor. Această metodă păstrează acidul nucleic și proteinele prin menținerea țesutului înghețat pe tot parcursul procesului. Creierele sunt tăiate în secțiuni de 0,5 până la 1,0 mm folosind o matrice cerebrală și așezate pe o placă de sticlă înghețată. Reperele din fiecare secțiune sunt comparate cu o referință, cum ar fi Allen Mouse Brain Atlas, iar regiunile sunt disecate folosind un bisturiu rece sau un pumn de biopsie. Țesătura este apoi depozitată la -80 ° C până la utilizare. Prin acest proces mPFC de șobolan și șoarece, nucleul accumbens, hipocampul dorsal și ventral și alte regiuni au fost analizate cu succes folosind teste qRT-PCR și Western. Această metodă este limitată la zonele creierului care pot fi identificate prin repere clare.

Introducere

Această lucrare ilustrează disecția regiunilor creierului înghețate pentru extracția proteinelor acide de înaltă calitate sau a acidului nucleic folosind o referință, cum ar fi Allen Mouse Brain Atlas 1, ca un ghid. În această tehnică, creierele sunt înghețate și depozitate la -80oC pentru secțiunea ulterioară și disecție, în timp ce sunt menținute într-o stare înghețată. Acest proces permite cercetătorului să recolteze un număr mare de creiere într-o singură sesiune și să le disecă mai târziu pentru colectarea exactă din mai multe regiuni ale creierului.

Colectarea exactă a regiunilor cerebrale de interes (ROI) este adesea necesară atunci când răspundeți la întrebări legate de expresia genelor și proteinelor. În timp ce farmacologia, electrofiziologia și optogenetica pot fi utilizate pe rozătoare de tip sălbatic sau modificate genetic pentru a ajuta la elucidarea modificărilor moleculare care stau la baza comportamentelor observate 2, 3, 4, măsurarea modificărilor induse în transcriptomi și proteomi este adesea folosită pentru a susține aceste descoperiri. Tehnici precum reacția în lanț cantitativă a polimerazei inverse (RT-qPCR), balonarea occidentală, ARNseq 5, MAPSeq 6 și HPLC 7 sunt robuste și relativ scăzute, permițând multor laboratoare să studieze modificările moleculare induse în regiunile mici ale creierul 2, 4, 5, 6 .

Disecția cu micropunch pe țesutul înghețat nu este nouă. Primele lucrări ale lui Miklos Palkovits și alții descriu în detaliu tehnicile de bază 14, 15. Această prezentare urmează în mare măsură lucrărilor inițiale, cu unele îmbunătățiri pentru a facilita eficiența și a reduce cheltuielile cu echipamentele necesare. De exemplu, secțiunile creierului sunt realizate într-un bloc cerebral înghețat, mai degrabă decât pe un criostat. Acest lucru produce secțiuni mai groase care reduc numărul de secțiuni necesare pentru colectarea probelor ROI. Această metodă disecă și probele pe o placă de sticlă înghețată care se sprijină pe gheață uscată într-o cutie izolată. Aceasta produce o etapă de sub-îngheț pe bancă pentru a lucra. Secțiunile disecate în acest mod sunt ușor de manipulat, permițând cercetătorului să compare ambele părți ale fiecărei secțiuni cu o referință pentru a limita contaminarea regiunilor din afara ROI dorit.

Avantajele acestui protocol sunt că 1) creierul este menținut într-o stare înghețată pe tot parcursul procesului, ceea ce ajută la conservarea proteinelor și a acidului nucleic și oferă cercetătorului timp pentru a recolta cu atenție AI și 2) reactivii necesari sunt ieftini și pot fi găsiți în majoritatea laboratoarelor de biologie moleculară. În acest proces, creierele întregi sunt secționate la 0,5-1,0 mm într-o matrice cerebrală și plasate pe o placă de sticlă înghețată care este răcită continuu cu gheață uscată. Repere găsite în Allen's Brain Atlas 1 sau alte atlase cerebrale 16, 17 sunt utilizate pentru a identifica regiunile de interes, care sunt apoi disecate folosind un pumn rece sau bisturiu. Deoarece țesutul nu este dezghețat niciodată, regiunile recoltate în acest mod oferă ARN și proteine ​​de înaltă calitate pentru analize din aval.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Animalele utilizate în acest studiu au fost tratate într-o manieră etică și umană, după cum a raportat Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) de la Universitatea Indiana și Ghidurile naționale.

NOTĂ: Toate uneltele și suprafețele trebuie spălate cu un solvent adecvat pentru a îndepărta nucleazele 18 înainte de a începe orice lucrare.

1. Depozitarea creierului

  1. Îndepărtați rapid creierele de la șoareci de hârtie sălbatică CD1 adulți eutanasiați, cântărind aproximativ 30 g, utilizând o abordare convențională 13 și înghețați blițul timp de 60 de secunde în azot lichid sau izopentan pre-răcit cu gheață uscată.
  2. Păstrați creierele înghețate la -80 ° C în folie de aluminiu sau tuburi conice până la utilizare.

2. Pregătirea matricei cerebrale

  1. Cu douăzeci și patru de ore înainte de disecarea țesutului, plasați o matrice cerebrală curată (a se vedea tabel material)pe un teanc de pachete de congelator dezghețate. Îndepărtați părțile laterale ale matriței între două pachete de congelator, asigurându-vă că lăsați aproximativ 0,5 cm între partea inferioară a fantei de ras și partea superioară a pachetelor de gel (Figura 1A). Așezați folie de aluminiu pe capete pentru a facilita răcirea.
    NOTĂ: Când achiziționați o matrice cerebrală, cumpărați una care este suficient de mare pentru a cuprinde întregul volum al creierului care urmează să fie disecat.
  2. Așezați cutia care conține matricea creierului și pachetele de congelator într-un congelator de -20oC cu partea superioară întredeschisă peste noapte.

3. Amplasarea unei plăci de sticlă congelate